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Titelaufnahme

Titel
Phosphorylation of Kv7 channels / submitted by Fatma Asli Erdem
Weitere Titel
Phosphorylierung von Kv7-Kanälen
Verfasser / VerfasserinErdem, Fatma Asli
Begutachter / BegutachterinYang, Jae-Won
ErschienenWien, 2016
UmfangIII, 92, XXIV Seiten
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Datum der AbgabeDezember 2016
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Kv7 / Phosphorylierung / Massenspektrometrie / Oberflächenexpression / Untereinheitassemblierung / PIP2-Bindung
Schlagwörter (EN)Kv7 / phosphorylation / mass spectrometry / surface expression / subunit assembly / PIP2 binding
Zugriffsbeschränkung
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Phosphorylation of Kv7 channels [12.61 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Kv7-Kanäle sind eine Familie von spannungs-gesteuerten Ionenkanälen, die durchlässig für Kalium-Ionen sind und durch ihre charakteristischen „M-Ströme“ die Erregbarkeit von Zellen steuern. 5 Isoformen sind dieser Gruppe zugewiesen, wobei die Untereinheiten Kv7.2, Kv7.3 und Kv7.5 in Neuronen exprimiert werden. Kv7.3 bildet Heteromere mit Kv7.2 und Kv7.5. Mutationen in Kv7.2 und Kv7.3 können Erkrankungen wie Epilepsie auslösen, während Kv7.5 im Zusammenhang mit Autismus berichtet wurde. Die Regulierung der Kv7-Kanäle kann durch Gq-gekoppelte Rezeptoren oder Phosphorylierung passieren, einer post-translationalen Modifikation. Bei der Gq-gekoppelten Hemmung ist bekannt, dass diese durch die Reduktion von Phosphatidyl inositol-4,5-bisphosphat (PIP2) oder durch die Erhöhung von intrazellulärem Kalzium geschieht. Eine Rolle für Phosphorylierung wurde durch Aktivierung oder Hemmung von Kinasen beschrieben, wobei für Kv7.2 und Kv7.3 sogar einige Phosphorylierungsstellen gefunden wurden. Jedoch fehlt bis dato eine umfassende Übersicht über Phosphorylierungsstellen von all diesen Untereinheiten. Das Zweck dieser Arbeit war somit, Serin/Threonin-Phosphorylierungsstellen in Kv7.2, Kv7.3 und Kv7.5 zu identifizieren und mit Hilfe von verschiedenen biochemischen Methoden deren Rolle in der Funktion dieser Untereinheiten herauszufinden. Mit Hilfe der Flüssig-Chromatographie-gekoppelten Massenspektrometrie wurde Phosphorylierung von Kv7.2, Kv7.3 und Kv7.5 in transfizierten Zellen und dem Rattenhirn als nativem Gewebe festgestellt. Ergebnisse zeigen, dass bei jeder Untereinheit Phosphorylierung hauptsächlich am C-terminalen Ende passiert und nur eine einzige Phosphorylierungsstelle am N-terminus vorhanden ist. Diese Stellen waren hauptsächlich Serine und im heterologen System und dem Hirn größtenteils ähnlich. Um die Kinasen zu identifizieren, die für die Phosphorylierung der Stellen verantwortlich sind, wurden in vitro Phosphorylierungsreaktionen mit aufgereinigten C-termini ausgeführt. Die cyclin-abhängige Kinase 5 (CDK5), mitogen-assozierte Proteinkinase p38 (p38 MAPK) und Proteinkinase A (PKA) waren für die Phosphorylierungsstellen von Kv7.2 verantwotlich, wobei die Calmodulin-abhängige Kinase 2 (CamKII) nur eine einzige Stelle phosphorylierte. Eine Gruppe von fünf Phosphorylierungsstellen wurde in einer möglichen PIP2-Bindungsregion lokalisiert. Die zuständigen Kinasen wurden mit spezifischen Inhibitoren gehemmt, sodass die Phosphorylierung am aufgereinigtem Wildtyp C-terminus von Kv7.2 verringert war. Pulldown mit PIP2-beschichteten beads wurde getestet, um die Bindungsstärke der wildtyp bzw. mutierten Kv7.2 zu testen, was jedoch keine Unterschiede aufwies. Der Kv7.3 C-terminus wies 3 Phosphorylierungsstellen auf, die von CDK5 und der Glykogen synthase kinase 3 (GSK3) phosphoryliert wurden. Mutationen von Stellen, die in der Assemblierungsdomäne lokalisiert waren, wiesen keine Änderungen in der Interaktion mit Kv7.2 oder der Oberflächenexpression auf. Kv7.5 C-terminus zeigte 9 Phosphorylierungsstellen im C-terminalen Ende, wo eine spezifische Stelle von den durch zyklische Nukleotide regulierten Kinasen Proteinkinase A, C und G phosphoryliert wurde. Zusätzlich war eine weitere Stelle durch PKC phosphoryliert, während CamKII nur für eine Stelle spezifisch war. Vier der Stellen waren in einer Region zu finden, die homolog zu der PIP2-Region in Kv7.2 ist. Jedoch bleibt die physiologische Rolle unklar. Zusammengefasst berichtet diese Arbeit über Phosphorylierungsstellen von Kv7.2, Kv7.3 und Kv7.5 und über experimentelle Ansätze, um die funktionelle Rolle dieser Phosphorylierungen herauszufinden.

Zusammenfassung (Englisch)

K v 7 channels are a subfamily of voltage-gated channels conducting potassium. They give rise to M currents, regulating the excitability of cells. The family consists of 5 members where Kv7.2, Kv7.3 and Kv7.5 are the neuronal subunits expressed, usually occurring as heterotetramers. Mutations in Kv7.2 and Kv7.3 may cause diseases such as epilepsy, while Kv7.5 is linked with autism. Regulation of Kv7 channels occurs via Gq-coupled receptors or phosphorylation. The Gq-coupled regulation has been studied extensively and is known to be mediated by phosphatidyl inositol-4,5-bisphosphate (PIP2) depletion or increase of cytosolic Ca2+. Activation or inhibition of kinases was shown to modulate M currents. Some phosphorylation sites were suggested for both Kv7.2 and Kv7.3. However, a comprehensive map of phosphorylation sites on Kv7.2, Kv7.3 and Kv7.5 was still missing. Hence, this work aimed to identify serine/threonine phosphorylation sites in these Kv7 subunits and investigate their functional role by using various biochemical techniques. Liquid chromatography-coupled mass spectrometry was used to detect phosphorylation sites in Kv7.2, Kv7.3 and Kv7.5 in both transfected cells and native tissue rat brain. In each subunit, one phosphorylation site was identified at the N-terminus while several more localised in the C-terminus. The sites, mainly serine residues, mostly overlapped in both heterologous expression and brain. In vitro phosphorylation assays were performed on purified C-termini to reveal kinases phosphorylating the identified sites. Cycline-dependent kinase 5 (CDK5), mitogen-associated protein kinase p38 (p38 MAPK) and protein kinase A (PKA) phosphorylated several residues in Kv7.2, while Calmodulin kinase II (CamKII) was only phosphorylating one specific site. A cluster of five phosphorylation sites was localised in a putative regulatory binding region for PIP2 of Kv7.2. Inhibition of the kinases with their respective compounds reduced the amount of phosphorylation in purified C-termini of wildtype Kv7.2 but did not affect the reduced phosphorylation of Kv7.2 with carrying alanine replacements in the cluster. The heterologously expressed Kv7.3 C-terminus harbours 3 phosphorylation sites which are phosphorylated by CDK5 and glycogen synthase kinase 3 (GSK3). Alanine mutants of four residues clustered in the assembly domain neither altered the interaction with Kv7.2, nor the surface expression. 9 phosphorylation sites were detected in the C-terminus of Kv7.5 where one specific site was phosphorylated by the cyclic nucleotide-gated kinases PKC, PKA and PKG. PKC additionally phosphorylated a further residue, while CamKII was specific for one serine residue. Four of the identified C-terminal phosphorylation sites localised in a region homologous to the PIP2D binding region of Kv7.2. In summary, this thesis provides a comprehensive map of phosphorylation sites and reports about approaches used to study their functional role.

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