Titelaufnahme

Titel
Proof of concept to collect and pre-enrich circulating tumor cells using leukapheresis, elutriation and fluorescence-activated cell sorting / submitted by Robert L. Eifler
Verfasser / VerfasserinEifler, Robert
Begutachter / BegutachterinZeillinger, Robert ; Freissmuth, Michael ; Fischer, Michael
Erschienen2010
UmfangGetr. Zählg. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2010
Anmerkung
Abstract, Kurzfassung
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Eirstockkrebs / zirkulierenden Tumorzellen / Anreicherung / Isolation / Leukapherese / Elutriation / Fluorescence-Activated Cell Sorting
Schlagwörter (EN)ovarian cancer / circulating tumor cell / enrichment / isolation / leukapheresis / elutriation / fluorescence-activated cell sorting
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-4759 Persistent Identifier (URN)
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Proof of concept to collect and pre-enrich circulating tumor cells using leukapheresis, elutriation and fluorescence-activated cell sorting [9.97 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Absicht: Die Anwendbarkeit eines Dreistufen-Prozesses bestehend aus Leukapherese, Elutriation und Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) zur Isolation und Anreicherung von zirkulierenden Tumorzellen aus großen Blutmengen zu Analysezwecken wurde getestet.

Experimentelles Design: Mononukleäre Zellen wurden von 10 L Blut mittels Leukapherese von 10 gesunden männlichen Spendern gewonnen und mit Carboxyfluorescein-Succinimidyl-Ester (CFSE) markierten CaOV-3 Tumorzellen im Verhältnis 26 zu 106 Leukozyten versetzt. Die Leukapheresate wurden mittels Elutriation nach Zellgröße in fünf bis sechs Fraktionen getrennt. Die Verteilung der Leukozyten bzw.

Tumorzellen in den unterschiedlichen Fraktionen wurde mit Hilfe von Durchflusszytometrie quantifiziert, wobei Tumorzellen als CFSE+/EpCAM+/CD45- Events charakteriziert wurden. Die weitere Isolation der angereicherten Tumorzellen erfolgte mittels FACS (CFSE+/EpCAM+/CD45-) bzw. durch die Bindung an anti-EpCAM gekoppelte magnetische Beads. Die Ausbeute und Reinheit der Tumorzellen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie und real-time PCR ermittelt.

Ergebnisse: Mittels Leukapherese wurden mononukleäre Zellen im Ausmaß von 13.53.6x109 mit einer durchschnittlichen Effizienz von 87% gewonnen. 53% bis 78% der gespikten Tumorzellen befanden sich in der letzten Elutriationfraktion zusammen mit 1.60.6x109 Monozyten. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Untersuchungen wurde eine Tumorzellen Reinheit von 5821% und circa eine 60,000-fache Anreicherung mittels des verwendeten Drei-Stufen Prozesses (Leukapherese, Elutration und FACS) vorausberechnet. Diese Ergebnisse wurden durch FACS bestätigt. Unter der Verwendung von immunomagnetischen Beads konnten 10.54.4% der Tumorzellen mit einem Medianwert von 3.5% Reinheit gewonnen werden.

Konklusion: In dieser "Proof-of-Concept" Studie konnte gezeigt werden, dass sich Elutriation und FACS nach Leukapherese als geeignete Methoden zur Anreicherung und Isolation lebender Tumorzellen aus großen Blutmengen für die molekulare Charakterisierung erweisen.

Zusammenfassung (Englisch)

Purpose: To determine the applicability of a sequential three-step process using leukapheresis, elutriation and fluorescence-activated cell sorting (FACS) to enrich and isolate circulating tumor cells from a large blood volume to allow further molecular analysis. Experimental Design: Mononuclear cells were collected from 10 male healthy donors by circulating 10 L of blood by leukapheresis, to which carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) pre-labeled CaOV-3 tumor cells were spiked at a ratio of 26 to 106 leukocytes. Elutriation separated the spiked leukapheresates by cell size into distinct fractions, and the distribution of leukocytes and tumor cells were quantified by flow cytometry analysis with tumor cells classified as CFSE positive, epithelial adhesion molecule (EpCAM) positive and CD45 negative events. Enriched tumor cells were then isolated using FACS (CFSE+/EpCAM+/CD45-) or anti-EpCAM coupled immunomagnetic beads, and their recovery and purity determined by fluorescent microscopy and real-time PCR.

Results: Leukapheresis collected 13.53.6x109 mononuclear cells with an average efficiency of 87%. 53 to 78% of spiked tumor cells were pre-enriched in the last elutriation fraction among 1.60.6x109 monocytes. Flow cytometry predicted a circulating tumor cell purity of 5821% giving an enrichment of approximately 60,000-fold using the three-step process (leukapheresis, elutriation and FACS). FACS confirmed this purity. Immunomagnetic bead adsorption recovered 10.54.4% of tumor cells with a median purity of 3.5%. Conclusion: This proof of concept study demonstrated that elutriation and FACS following leukapheresis are able to enrich and isolate viable tumor cells from a large blood volume for molecular characterization.