Titelaufnahme

Titel
Spatio-temporal analysis of the Src family kinase Lck during T cell activation / submitted by Paul Eckerstorfer
Verfasser / VerfasserinEckerstorfer, Paul
Begutachter / BegutachterinStockinger, Hannes
Erschienen2013
UmfangXIII, 141 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2013
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)T-Zell-Aktivierung / Lck / Membran-Mikrodomäne / Signaltransduktion / Jurkat Zellen / Mikroskopie
Schlagwörter (EN)T cell activation / Lck / membrane microdomains / signal transduction / Jurkat cells / microscopy
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-7415 Persistent Identifier (URN)
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Spatio-temporal analysis of the Src family kinase Lck during T cell activation [30.89 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Stimulierung des T-Zell-Antigen-Rezeptors (TZR) aktiviert eine Signalkaskade, die zur Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von T-Zellen führt. Die Src-Familien Kinase Lck spielt am Beginn dieser Prozesse eine wichtige Rolle, da Lck Tyrosinreste des TZR/CD3 Komplexes phosphoryliert. Jedoch ist der exakte Mechanismus der Umwandlung von TZR-Stimulierung in Lck vermittelte Phosphorylierung des TZR/CD3 Komplexes noch völlig unklar. Wir identifizierten die räumliche Trennung von Lck und dem TZR/CD3 Komplex als einen wesentlichen regulatorischen Mechanismus. Dadurch wird eine unkontrollierte Aktivierung unstimulierter T-Zellen verhindert. Abhängig vom Expressionslevel von Lck spielt die räumliche Trennung eine wesentliche Rolle für die Feinregulation der Stärke der Reaktion. Untersuchungen der molekularen Mechanismen, welche für diese Barriere verantwortlich sind, haben gezeigt, dass ,Lipid Rafts' und Proteinkomplexformierungen von Lck und CD3 eine wichtige Rolle in diesem Prozess spielen. Die meisten aktiven Lck Moleküle waren mit 'Lipid Rafts' assoziiert, im Gegensatz zu den inaktiven Lck Molekülen, welche vorwiegend außerhalb von 'Lipid Rafts' zu finden waren. Da in unstimulierten T-Zellen der TZR/CD3 Komplex nicht in den 'Lipid Rafts' vorhanden ist und erst nach T-Zell- Stimulation in die 'Lipid Rafts' einwandert, wurde diese exakte räumliche und zeitliche Regulierung von Lck und dem TZR/CD3 Komplex durch 'Lipid Rafts' als wichtiger Kontrollmechanismus der T-Zell- Aktivierung identifizert. Dieses Ergebnis wurde durch Größenausschlusschromatographie-Untersuchungen bestätigt. Es wurde keine Überlappung von CD3 Proteinkomplexe und Proteinkomplexe mit aktivem Lck in umstimulierten T-Zellen beobachtet. Einzelmolekülanalysen in lebenden Zellen mittels ultrasensitiver Mikroskopie ergaben ca. 40% Lck- Homodimere und Lck-Homomultimere. Die erzwungene Lck Dimerisierung mit Hilfe eines induzierbaren Lck-Dimerisierungssystems aktivierte frühe Signalereignisse (Phosphorylierung von CD3 und ZAP70, erhöhten intrazellulären Kalziumspiegel), jedoch keine späten Signalereignisse (Aktivierung der MAP Kinasenkaskade oder Oberflächenexpression von CD69). Für die Aktivierung des frühen TZR Signalweges induziert durch Lck Dimerisierung sind der N-terminale Membrananker, das aktivierende Tyrosin394 von Lck und die Organisierung der Mikrotubuli unverzichtbar. Daher repräsentieren sowohl die räumliche Trennung von Lck und dem TZR/CD3 Komplex als auch die Homodimerisierung von Lck wichtige regulatorische Mechanismen, um die Kinaseaktivität von Lck und infolgedessen die T-Zell-Aktivierung zu kontrollieren.

Zusammenfassung (Englisch)

T cell antigen receptor (TCR)-engagement initiates a signaling cascade leading to T cell activation, proliferation and differentiation. The Src family kinase Lck plays a key role in the onset of this process by phosphorylating tyrosine residues within the TCR/CD3 complex. However, the exact mechanism how Lck translates TCR-engagement into phosphorylation of the TCR/CD3 complex remained elusive. Here, we identified a crucial regulatory mechanism in the spatial separation of Lck and the TCR/CD3 complex. Thereby, uncontrolled T cell activation in unstimulated T cells is prevented. Moreover, the spatial separation is essential for fine-tuning the strength of response dependent on the expression level of Lck. Investigation of the molecular mechanisms responsible for this physical barrier revealed that plasma membrane lipid rafts as well as protein complex formation of Lck and CD3 play key roles in this process. We found that active Lck molecules associated with lipid rafts, in contrast to inactive Lck molecules remaining predominantly outside of lipid rafts. Since the TCR/CD3 complex is excluded from rafts in unstimulated T cells and partially associated with lipid rafts upon T cell stimulation, a tight spatio-temporal regulation of Lck and the TCR/CD3 complex by lipid rafts was identified as an important regulatory mechanism controlling T cell activation. This finding was further corroborated by size exclusion chromatography experiments. In unstimulated T cells no overlap of CD3 protein complexes together with protein complexes containing active Lck was observed. Single molecule analysis of Lck by ultrasensitive microscopy revealed 40% Lck homodimers/homomultimers in live cells. Forced dimerization of Lck by an inducible Lck-dimerization system induced early signaling events (phosphorylation of CD3 and ZAP70, increased intracellular calcium levels), but not late ones (activation of the MAP kinase pathway or CD69 surface expression). For this Lck dimerization-mediated early TCR signaling, we found the N-terminal membrane anchor and the activatory Tyr394 residue of Lck as well as microtubules' organization indispensible. Thus, both spatial separation of Lck and the TCR/CD3 complex and homo-dimerization of Lck represent novel regulatory mechanisms for controlling the kinase activity of Lck and consequently T cell activation.