Titelaufnahme

Titel
Characterization of wheat antigens in celiac disease / submitted by Bharani Srinivasan
VerfasserSrinivasan, Bharani
Begutachter / BegutachterinValenta, Rudolf
Erschienen2014
Umfang143 S. : Ill., graph. Darst., Kt.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
Quelle der Aufnahme
1. Amino Acids, 2013, 45, 889-900 ; 2. Methods, 2014, 66, 106119
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Zöliakie / Weizenantigene / Massenspektrometrie / rekombinantes / gamma-gliadin / IgA-reaktives / immundominante / Epitope
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-948 Persistent Identifier (URN)
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Characterization of wheat antigens in celiac disease [12.23 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Zöliakie ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des Dünndarms, die als eine CD4+ T-Zell-vermittelte Immunreaktion auf Gluten in Nahrungsmitteln aus Weizenprodukten auftritt. Zöliakie ist stark assoziiert mit den genetischen Markern HLA DQ2/DQ8 und betrifft ungefähr 1% der europäischen sowie nordamerikanischen Bevölkerung. Glutenproteine sind komplexe Aggregate bestehend aus zwei Untereinheiten, den Gliadinen und den Gluteninen. Da diese Glutenproteine für Entzündungsreaktionen verantwortlich sind, kann man unter der Verwendung der relevanten Proteine die zugrundeliegenden Pathomechanismen studieren. Jedoch kennt man die krankheitsauslösenden Antigene nicht. Deshalb war die Identifizierung, Klonierung, Expression sowie biochemische und immunologische Charakterisierung Zöliakie-spezifischer Weizenantigene das Ziel dieser Dissertation. Zunächst wurde eine Methode entwickelt, mittels der man sowohl die Proteineigenschaften als auch die immunologische Relevanz untersuchen kann, und mit der wir unter der Verwendung von Seren von an Zöliakie erkrankten Patienten Weizenantigene identifizieren können, die in der Erkrankung eine Rolle spielen. So haben wir das Zöliakie-spezifische gamma-gliadin mit einem Molekulargewicht von 37 kDa entdeckt, dessen Identität durch Massenspektrometrie bestätigt wurde. Nach der Klonierung des gamma-gliadin 1 (GG1) Gens, haben wir das rekombinante Antigen in Escherichia coli exprimiert und gereiningt. Die biochemische Charakterisierung hat gezeigt, dass rekombinantes gamma-gliadin 1 (rGG1) in physiologischen Lösungen unlöslich und ungefaltet ist, sowie hochmolekulare Aggregate bildet. Im Zuge der immunologischen Charakterisierung haben wir die IgA-Reaktivität von Zöliakiepatienten sowie Kontrollpatienten in Bezug auf rGG1 getestet. Das rekombinante gamma-gliadin wurde von 73% der Zöliakiepatienten mit einer Spezifität von 93% erkannt. Deshalb ist das rekombinante gamma-gliadin (rGG1) ein spezifisches, IgA-reaktives Hauptantigen in der Weizen-vermittelten Zöliakie. Zusätzlich wurde es von der Mehrheit der Dermatits herpetiformis (DH) Patienten spezifisch erkannt und kann deshalb als ein serologischer Marker für die DH-Diagnose verwendet werden. Dadurch dass Zöliakiepatienten, die sich an eine glutenfreien Ernährung halten, ihre Reaktivität auf rGG1 verloren haben, konnte die Spezifität von gamma-gliadin in der Zöliakie bestätigt werden. Aus diesem Grund kann man mittels rGG1 die Beständigkeit der Erkrankung in Zöliakiepatienten mit glutenfreier Diät beobachten. Weiters haben wir synthetische, überlappende Peptide von rGG1 verwendet und die N-terminale Prolin-/Glutamin-reiche Region als stark IgA-reaktiv identifiziert wobei sich gezeigt hat, dass zwei der Peptide immundominante Epitope enthalten. Wir haben auch gezeigt, dass diese Prolin-/Glutamin-reiche Region resistent gegen enzymatische Verdauung ist, was eine wichtige Eigenschaft für Krankheits-auslösende Antigene darstellt. Anhand von rGG1 und den vorliegenden Ergebnisse kann man den Krankheitsmechanismus untersuchen und neue Strategien entwickeln um Zöliakie zu behandeln und zu diagnostizieren.

Zusammenfassung (Englisch)

Celiac disease (CD) is a severe pathological condition of the small intestine caused by CD4+ T cell-mediated inflammatory response to dietary gluten. CD is strongly associated with HLA DQ2/DQ8 genetic background and can affect 1% of the European and North American population. Gluten proteins are complex aggregates of two subunits called gliadins and glutenins. Among the gluten proteins, those which are involved in eliciting the inflammatory response are important candidates for studying the pathogenic mechanism, but the identity and complete profile of disease causing antigens is not available.

Therefore, the aims of my thesis were the identification, cloning, expression, biochemical and immunological characterization of CD-specific wheat antigens. We therefore, developed a combined proteomic and immunological approach using CD patient sera for identifying wheat antigens involved in CD. We identified [gamma]-gliadins with a molecular mass of 37 kDa to be highly CD-specific and the identity of the 37 kDa [gamma]-gliadin protein was deduced by mass spectrometry. The [gamma]-gliadin 1 (GG1) gene was cloned, expressed and purified as a recombinant antigen in Escherichia coli. Biochemical characterization was performed with the recombinant [gamma]-gliadin 1 (rGG1), which revealed that rGG1 was insoluble in physiological solutions, unfolded and formed high molecular weight aggregates. Immunological characterization was performed by studying the IgA reactivity of CD and control patients to rGG1. The rGG1 protein was a recognized by 73% of CD patients, with a CD-specificity of up to 93%. Thus rGG1 was a major CD-specific IgA-reactive wheat antigen. The protein was also specifically recognized by the majority of Dermatitis herpetiformis (DH) patients and therefore could serve as a candidate marker for DH diagnosis. The specificity of rGG1 with CD condition was further demonstrated by showing that treated CD patients lost their reactivity to rGG1 when they were put on a gluten-free diet (GFD). Thus rGG1 could be used for monitoring the adherence of CD patients to GFD. Further, we used synthetic overlapping peptides of rGG1 and identified that the N-terminal proline/glutamine-rich region was highly IgA reactive, among which two peptides were the major immunodominant epitopes. We also demonstrated that this proline/glutamine-rich region was resistant to enzymatic digestion, a feature important for disease eliciting antigens.

Current results should be useful for understanding the disease mechanism and for developing strategies for treating and diagnosing CD.