Titelaufnahme

Titel
The effects of high dose ionizing radiation on transcriptional regulation and paracrine signaling in human peripheral blood mononuclear cells / submitted by Lucian Beer
VerfasserBeer, Lucian
Begutachter / BegutachterinAnkersmit, Hendrik Jan
Erschienen2015
Umfang178 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)ionisierende Strahlung / Apoptose / PBMC / Exosomen / Mikropartikel / Phospholipide / Sekretome / regenerative Medizin / HPLC
Schlagwörter (EN)ionizing radiation / apoptosis / p53 / exosome / microparticle / phospholipids / HPLC / regenerative medicine / secretome
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5541 Persistent Identifier (URN)
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The effects of high dose ionizing radiation on transcriptional regulation and paracrine signaling in human peripheral blood mononuclear cells [6.81 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Parakrine Signalwege treten zunehmend in Focus des wissenschaftlichen Interesses im Feld der regenerativen Medizin. Während ursprünglich angenommen wurde, dass direkte Zell-Zell Interaktion und die Integration von injizierten Stammzellen ausschlaggebend für die Induktion von regenerativen Prozessen sind, zeigen neue Daten, dass es die von diesen Zellen freigesetzten parakrine Faktoren sind, welche zytoprotektiv und regeneratorisch wirken. Die Zellen werden heutzutage als Bioreaktoren gesehen, welche lösliche Faktoren freisetzen die als Therapeutikum eingesetzt werden können. Um die parakrine Kapazität dieser Zellen zu verstärken, sind so genannte Konditionierungsstrategien beschrieben. Unsere Arbeitsgruppe konnte in mehreren Publikationen zeigen, dass periphere mononukleäre Blutzellen eine Vielzahl an parakrinen Faktoren freisetzen, welche die Wundheilung beschleunigen, den Herzmuskel im Zuge eines akuten Infarktes schützen, die Verlegung der Mikrovaskulatur verhindern, das neurologische Outcome nach einem ischämischen Schlaganfall und traumatischer Rückenmarksverletzung verbessern und die Entwicklung einer autoimmun meditierten Myokarditis in der Maus verhindern. Obwohl diese Studien die gesehenen Effekte detailliert beschrieben haben, wissen wir derzeit nicht, welche biologischen Prozesse in den weißen Blutkörperchen im Zuge der ionisierenden Bestrahlung aktiviert oder supprimiert werden. Weiters ist unbekannt, welche parakrine Faktoren von den weißen Blutkörperchen freigesetzt werden.

Im Zuge dieser Doktorarbeit untersuchten wir die induzierten oder supprimierten zellulären Vorgänge in bestrahlen (60 Gray) weißen Blutkörperchen (25*10^6 Zellen/ml) als auch deren Sekretome. Durch Zuhilfenahme von bioinformatischen Auswertealgorithmen konnten wir komplexe mRNA und microRNA Interaktionsnetzwerke generieren, welche im Zuge der Bestrahlung vermehrt aktiviert werden. Es zeigte sich, dass der Transkriptionsfaktor hepatic leukemia factor (HLF) eine Schlüsselfunktion in der Regulation der mRNA und microRNA Netzwerke in irradiierten Zellen einnimmt. Weiters konnten wir feststellen, dass Bestrahlung zu einer vermehrten Freisetzung von Proteinen führt, welche die Zellmigration und Wundheilung induzieren. Bestrahlte weiße Blutkörperchen setzten oxidierte Phosphatidylcholine frei, welche bekannte entzündungsmodulierende und proangio-genetische Eigenschaften aufweisen. Weiters führte eine Bestrahlung der Zellen zu einer gesteigerten Ausschüttung von Mikropartikeln und Exosomen. In vitro Versuche identifizierten Proteine und Exosomen als die zwei Hauptkomponenten, welche zu einer gesteigerten Zellmigration und Zellaktivierung von Fibroblasten und Keratinozyten führten. In vivo Versuchen im Großtiermodel des akuten Herzinfarkts konnten wir erstmals zeigen, dass das Sekretome von weißen Blutkörperchen seine biologische Aktivität nicht verliert wenn es nach den Richtlinien des good manufacturing process hergestellt wird. Die herzmuskelschützende Wirkung war vergleichbar mit dem Zellsekretome, welches auf konventionelle Art hergestellt worden war. Aus diesen Daten lässt sich schließen, dass die biologisch wirksamen Komponenten stabil gegenüber einer externen Herstellung und den Lagerungsbedingungen sind. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass ionisierende Bestrahlung weißer Blutkörperchen zu einer Änderung der Genexpression, als auch der Freisetzung einer Vielzahl unterschiedlicher molekularer parakrine Faktoren führt. Diese Daten sollen die Grundlage für zukünftige Studien darstellen, welche die Rolle von Exosomen und Proteinen als Therapeutikum im Felde der regenerativen Medizin evaluieren.

Zusammenfassung (Englisch)

While it has long been accepted that direct cell-cell interactions and the replacement of injured tissues with injected cells exerts therapeutic effects, it is currently believed that, in addition, paracrine factors released from different cell types activate cytoprotective and regenerative processes. Cells are now seen as bioreactors that produce and release soluble factors which might be used as therapeutics. We have previously shown that peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) release a plethora of paracrine factors that enhance wound healing, attenuate myocardial damage following acute myocardial infarction, abolish microvascular obstruction, improve neurological outcome after acute ischemic stroke and spinal cord injury and protect mice from experimental autoimmune myocarditis. These PBMC derived paracrine factors may exert their effects via the induction of cytoprotective pathways, augmentation of angiogenesis, induction of NO-depended vasodilation and inhibition of VASP dependent platelet aggregation, as well as driving auto-reactive CD4+ cells into apoptosis.

To enhance the cellular secretory capacity, treatments which induce stress responses, such as hypoxic preconditioning or ionizing irradiation (IR), have been developed. Although these effects have been evaluated in several disease states there is little data available on the cellular effects of ionizing irradiation on human PBMCs and their secretome. In this study, we have thus undertaken to investigate the effects of IR on human PBMCs in terms of the induction of transcriptional changes and release of pleiotropic paracrine factors. There are three primary aims of this doctoral thesis: 1. To investigate cellular processes activated or repressed in human PBMCs following high dose ionizing radiation (60Gy) and high density cell cultivation (25*10^6 cells/ml) for up to 24 hours. 2. To identify paracrine factors released from these cells using a multi-methodical biochemical/bioinformatics approach. 3. To evaluate whether the viral cleared secretome, produced according to the good manufacturing practice (GMP) guidelines, retains its ability to attenuate acute myocardial infarction in a large animal model. Using this counterintuitive approach, a sophisticated mRNA and microRNA expression analysis coupled with bioinformatics revealed a complex interaction network activated in response to IR. Irradiated PBMCs released proteins involved in the regulation of cell migration and wound healing, produced oxidized phosphatidylcholines with known inflammation-modulating and angiogenic properties, and released higher amounts of microparticles and exosomes.

In particular, we were able to identify the transcription factor, hepatic leukemia factor (HLF), as a central node in these mRNA-microRNA-transcription factor regulatory networks, and showed it to be significantly repressed in irradiated PBMCs.

By using in vitro functional assays we were able to show for the first time that the protein fractions and exosomes were the main biologically active components that enhance cell migration and activation of fibroblasts and keratinocytes. A pathogen cleared, good manufacturing process produced PBMC secretome in a porcine closed chest model of acute myocardial infarction attenuated the myocardial damage as effectively as the control, indicating a high stability of the biologically active components. Our data may provide a basis for further studies to investigate the role of exosomes and proteins as a novel therapeutic approach in the field of regenerative medicine.