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Title
Proteinaceous RNase P / submitted by Christoph Weber
AuthorWeber, Christoph
CensorRossmanith, Walter
Published2013
Description150 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2013
Annotation
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)RNase P / Ribonuklease / tRNA / Prozessierung am 5 Ende / Hefe / POP8 / Komplementation / RPR1 / Ribozym / PRORP
Keywords (EN)PRORP / tRNA processing / RNase MRP, Yeast / Phenotypic profiling / PPR / POP8 / 5.8S rRNA / competitive growth / ribonuclease / ribozyme
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-4793 Persistent Identifier (URN)
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Proteinaceous RNase P [7.13 mb]
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Abstract (German)

Ribonuklease P (RNase P) ist eine Endonuklease, die die 5 Flanke von pre-tRNAs entfernt und somit essentiell für die Funktion von tRNAs in der Proteinsynthese ist. RNase P Enzyme kommen ubiquitär, in allen Organismen vor, jedoch in unterschiedlichster Form und Komplexität. Ursprünglich wurden RNase P Enzyme als Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexe beschrieben, in denen die RNA Untereinheit die katalytische Funktion inne hat. Die primitivste Form der RNase P, wie sie in Bakterien gefunden wird, besteht lediglich aus einer RNA Untereinheit und einem Protein. Mit steigender Komplexität der Organismen stieg auch die Anzahl der Protein Untereinheiten, wobei die katalytische Aktivität der RNA erhalten blieb. Dieser "Ribozym" Charakter des Enzyms war jahrelang ein Kennzeichen von RNase P Enzymen, bis zur Entdeckung des ersten "proteinaceous" RNase P (PRORP) Enzyms in humanen Mitochondrien. Dieses enthielt erstaunlicherweise keine katalytische RNA Untereinheit, sondern bestand lediglich aus drei Proteinen. Diese "proteinaceous" RNase P Enzyme wurden auch in Pflanzen und Trypanosomen gefunden. Es scheint als wären die als ursprünglich geltenden Ribozyme in einigen Organismen im Laufe der Zeit durch Protein-Enzyme ersetzt worden. Die genauen evolutionären Gründe für einen solchen Übergang von RNA- zu Protein-Katalyse liegen immer noch im Verborgenen. Um nun herauszufinden ob sich diese beiden RNase P Enzymklassen in ihrer Funktionsweise unterscheiden und ob RNP Enzyme aufgrund ihrer höheren Komplexität andere Prozessierungsaufgaben in der Zelle übernommen haben, führten wir eine Komplementationsanalyse durch indem wir "proteinaceous" RNase P Enzyme gegen das endogene RNP-Enzym in Hefe austauschten. Erstaunlicherweise waren Hefezellen mit diesem elementar verschiedenen RNase P Enzym nicht nur lebensfähig, sondern zeigten auch keinerlei signifikante Unterschiede in der Prozessierung von tRNAs. Darüber hinaus zeigten Stresstests, dass nur geringe Unterschiede in der Stressresistenz vorhanden sind, wenn Hefezellen "proteinaceous" RNase P Enzyme für die 5-tRNA-Reifung verwenden. In einem ganz speziellen Fall konnten wir sogar in zwei unabhängigen Tests feststellen, dass die Wachstumsleistung eines Hefestamms mit ausgetauschter RNase P die des Wildtyps übersteigt. Die gesammelten Ergebnisse zeigten, dass trotz fundamentaler Unterschiede im Aufbau, "proteinaceous" RNase P Enzyme funktionell gleichwertig mit komplexen RNP Enzymen sind. In einem separaten Projekt war es mithilfe von Hefestämmen, die PRORP anstelle der endogenen RNase P verwenden, möglich eine spezielle Proteinuntereinheit der RNase MRP zu untersuchen. Unsere Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die Proteinuntereinheit Pop8p unter normalen Wachstumsbedingungen nicht essentiell für die Funktion der RNase MRP ist. In weiterführenden Versuchen stellte sich jedoch heraus, dass das Pop8 Protein für die Stabilität des MRP- Ribonukleoproteins, beispielsweise unter Hochtemperaturstress, essentiell ist.

Abstract (English)

Ribonuclease P (RNase P) is the endonuclease responsible for the removal of the 5 extensions of immature tRNAs. As the enzymatic task encompasses a rather simple cleavage on tRNA precursors the diversity within the group of RNase P enzymes is striking. Initially RNase P was described as a ribonucleoprotein (RNP) in which the RNA moiety represents the catalytic center of the enzyme. During evolution the number of protein subunits of the RNP expanded from one in bacteria to 10 in the nucleus of Eukarya. Another class of RNase P enzymes, "proteinaceous" RNase P (PRORP), is completely devoid of RNA. The most striking difference between the two classes of RNase P enzymes found in the eukaryal nucleus is that in one case, a catalytic RNA forms a complex, high-molecular weight RNP with several proteins, whereas PRORP enzymes are active as a single monomeric protein. The evolutionary reason for preserving the primordial ribozyme in many eukaryal nuclei remains unclear. It was suggested that increased complexity of the RNP may have opened the door for expanding the range of non-tRNA processing targets. However, the finding that higher developed eukaryotic organisms, like plants or trypanosomatids exclusively rely on PRORP enzymes, challenges this view. This suggests that either a single protein is as versatile as a complex RNP, or the spectrum of biological functions of the two enzyme forms is different. To experimentally address this issue we replaced yeast nuclear RNase P with PRORP in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Astonishingly, yeast cells with proteinaceous RNase P enzymes from Trypanosoma brucei and Arabidopsis thaliana were viable, which enabled us to study and compare the most complex RNP form of RNase P to its most simple, one-protein-only form in vivo within the same cellular environment. Yeast cells with a proteinaceous RNase P instead of their endogenous RNP-RNase P enzyme did not show any decrease in mature tRNA levels or an increase in proposed non-tRNA substrates. Phenotypic profiling revealed that cells with a swapped RNase P were able to withstand a variety of stress factors in a similar manner as wild type cells. Surprisingly, RNase P-swapped yeasts in both analyzed genetic backgrounds showed higher resistance to sodium chloride stress. Moreover, we found by two independent assays that RNase P-swapped strains generated in the genetic background of BY4743 grew faster than their wild type counterparts, whereas in the CEN.PK background they were growing slower. In summary our results show that despite their fundamentally different structure and composition, PRORP enzymes are functionally equivalent to complex RNP enzymes. In a separate project focused on RNase MRP, RNase P-swapped strains were used to investigate the functional role of a specific RNase MRP protein subunit. Our results strongly suggest that the protein Pop8p is not essential for the function of RNase MRP under normal growth conditions. According to our analysis this specific protein has a stabilizing role for RNP complex that is only essential under high temperature-stress conditions