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Title
Rin-like, a novel regulator of endocytosis, acts as guanine nucleotide exchange factor for Rab5a and Rab22 / submitted by Barbara Woller
AuthorWoller, Barbara
CensorHerbst, Ruth
Published2011
Description96 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2011
Annotation
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Endozytose / Rab5 / GEF / MuSK / Rezeptortyrosinkinase / RIN
Keywords (EN)Endocytosis / Rab5 / GEF / MuSK / Receptor tyrosine kinase / RIN
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5067 Persistent Identifier (URN)
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Rin-like, a novel regulator of endocytosis, acts as guanine nucleotide exchange factor for Rab5a and Rab22 [27.36 mb]
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Abstract (English)

Rab GTPases, which cycle between GDP-bound inactive and GTP-bound active states, are central elements of the vesicular transport machinery. Importantly, Rab5 is a key element of early endocytosis and trafficking. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) control Rab activity and various proteins have already been identified as Rab5 GEFs.

These proteins all contain a highly conserved Vps9-domain that serves as GEF domain for Rab5 family GTPases, including Rab21, Rab22a and Rab31. A family of multifunctional Ras and Rab interactors (RINs) has been described that contain a N-terminal SH2 domain and RH, Vps9 and Ras-association domains in their C-terminal portion. At present, three RIN family members have been described and analyzed. They all serve as GEFs for Rab5 and at least one additional Rab5 family GTPase and seem to be involved in endocytosis and vesicular transport mechanisms.

Here we report the identification of a novel modulator of Rab5 activity, the Vps9 domain containing protein Rin-like (Rinl). Rinl shares high sequence homology and the overall domain structure with the RIN proteins but lacks the RA domain at its C-terminus. Noteworthy, Rinl has been isolated as new interaction partner of the muscle specific receptor tyrosine kinase MuSK and interacts with MuSK independent of its phosphorylation. Signal transduction events triggered by MuSK are essential for neuromuscular synapse (NMS) formation and maintenance.

Experimental evidence shows that Rinl is localized to NMSs but the highest expression levels have been found in thymus and spleen. Rinl preferentially binds to GDP-bound Rab5a and catalyzes the exchange of GDP for GTP. The same interaction of Rinl was also found for GDP-Rab22a, but strikingly Rinl has a much stronger GEF activity towards Rab22a than Rab5a. Besides a diffuse, cytoplasmic distribution Rinl displays a characteristic localization pattern in vesicles and actin-positive membrane ruffles, implicating Rinl in endocytotic processes involving Rab5a and Rab22a. The Rinl Vps9 domain but not the SH2 domain is required for catalytic activity and cytoskeleton-associated membrane localization. Most importantly, overexpression of Rinl increases fluid-phase uptake as well as epidermal growth factor receptor endocytosis.

Besides the biochemical characterization of Rinl a gene targeting approach in mice has been performed, aiming to elucidate Rinl function and expression in vivo. Rinl-/- mice are viable and fertile. NMSs appear to develop normally and do not show any gross alterations in size and shape.

Abstract (German)

Rab GTPasen sind die molekularen Schalter intrazellulärer Transportmechanismen, die im Zytosol in der inaktiven, GDP-gebundenen Form vorliegen. Rab5 ist die bisher am ausführlichsten charakterisierte Rab GTPase, der eine Schlüsselrolle in der frühen Endozytose zugeschrieben wird. Beispielsweise assoziiert Rab5 mit der Plasmamembran, mit Clathrin-umhüllten Vesikeln, sowie frühen Endosomen und ist nach aktuellem Wissensstand limitierend für den Endozytosevorgang. Zusammen mit Rab21, Rab22a und Rab31 repräsentiert sie die Rab5 Familie kleiner GTPasen. Die Aktivierung von Rab GTPasen erfolgt durch den Austausch von GDP gegen GTP und wird durch sogenannte "Guanin Nukleotid Exchange Factors" (GEFs) gesteuert.

Eine Reihe unterschiedlichster Proteine aktiviert die GTPasen der Rab5 Familie mittels der evolutionär konservierten und hochselektiven Vps9 GEF Domäne. Besonderes hervorheben möchte ich hier die Gruppe der RIN (Ras/Rab interactor) Proteine - bestehend aus Rin1, Rin2, Rin3 -, welche eine N-terminale SH2 Domäne, sowie eine Vps9 und RA Domäne an ihrem C-Terminus besitzen. Alle RIN Proteine fungieren als GEF für Rab5 und mindestens eine weitere GTPase der Rab5 Familie. Dadurch sind sie wichtige Steuerungselemente in der Endozytose- und Transportmaschinerie einer Zelle.

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wird ein neuer GEF für Rab5 GTPasen beschrieben: Rin-like (Rinl). Rinl ist ein neuer Interaktionspartner der muskelspezifischen Rezeptortyrosinkinase MuSK, die Interaktion der beiden Proteine ist unabhängig vom Aktivierungs- beziehungsweise Phosphorylierungsstatus von MuSK. Die Aktivierung von MuSK und die nachgeschalteten Signalkaskaden sind für die Bildung und Erhaltung der neuromuskulären Synapse (NMS) essentiell. Eine Anreicherung von Rinl an der NMS konnte experimentell nachgewiesen werden, allerdings enthalten die Lymphgewebe Milz und Thymus deutlich höhere Konzentrationen des Rinl Proteins. Rinl interagiert vorzugsweise mit der inaktiven, GDP-gebundenen Form von Rab5a und Rab22. Die GEF Aktivität von Rinl für Rab5a und Rab22 wurde experimentell bestätigt, wobei eine deutlich höhere stimulierte Austauschrate bei Rab22 festzustellen war. Rinl zeigt unterschiedliche intrazelluläre Lokalisierungsmuster, die einzeln oder gemeinsam auftreten: diffus/zytoplasmatisch bzw. vesikel- oder membranassoziiert. Ein charakteristisches Lokalisierungsmuster stellt die Anreicherung von Rinl in Aktin-positiven Membraneinfaltungen, sogenannten "membrane ruffles" dar. In umfangreichen Deletionsstudien konnte gezeigt werden, dass die Lokalisierung von Rinl an der Zellmembran, sowie die katalytische Aktivität als Rab5 GEF das Vorhandensein der vollständigen Vps9 Domäne voraussetzt. Die SH2 Domäne ist dafür nicht notwendig. Rinl scheint direkt, oder indirekt an der Steuerung von Endozytose- und vesikulären Transportprozessen beteiligt zu sein, da eine Überexpression von Rinl mit einer gesteigerten Endozytoseaktivität der Zellen einhergeht. Wir konnten experimentell nachweisen, dass Rinl die Endozytose des EGF-Rezeptors sowie die rezeptorunabhängige Pinozytose - gemessen an der Aufnahme des Flüssigkeitsphase-Markers Meerrettich-Peroxidase - erhöht.

Neben der biochemischen Charakterisierung von Rinl wurde eine Inaktivierung (Deletion) von Rinl in Mäusen durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen durchgeführt. Rinl-/- Mäuse sind überlebensfähig und fertil, neuromuskuläre Synapsen entwickeln sich normal.