Titelaufnahme

Titel
Interactome and regulation of the putative resolvase "Ankyrin repeats and LEM domain-containing protein 1" (Ankle1) / submitted by Prof. Livija Zlopaša, M.A., M. Sc.
Weitere Titel
Interaktom und die Regulation der mutmasslichen Resolvase "Ankyrin repeats and LEM domain-containing protein 1" (Ankle1)
VerfasserZlopaša, Livija
Begutachter / BegutachterinFoisner, Roland
ErschienenWien, 2016
UmfangXX, 127 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Univ., Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Ankle1 / LEM Proteine / Resolvase
Schlagwörter (EN)Ankle1 / LEM protein / nuclear transport / resolvase
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-7690 Persistent Identifier (URN)
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Interactome and regulation of the putative resolvase "Ankyrin repeats and LEM domain-containing protein 1" (Ankle1) [20.67 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Kernhülle eukaryotischer Zellen besteht aus zwei Membranen, der äußeren und der inneren Kernmembran, die den Zellkern und das Zytoplasma voneinander trennen. Die Kernporen, die in den Kernmembranen integriert sind, erlauben den Transport von Molekülen zwischen Zellkern und Zytoplasma. Die innere Kernmembran enthält eine Vielzahl essentieller Transmembranproteine. Diese Proteine übernehmen wichtige Funktionen bei der dynamischen Organisation des Zellkerns, während des Zellzyklus und der Zelldifferenzierung. Ebenso steuern sie die Organisation und Aktivität von Chromatin. Die LAP-Emerin-MAN1 (LEM) Proteinfamilie umfasst eine strukturell und funktionell heterogene Gruppe von Proteinen der inneren Kernmembran, deren Gemeinsamkeit die sogenannte LEM Domäne ist. Diese beinhaltet ein 40 Aminosäuren langes Proteinmotiv. Die Interaktion von LEM Proteinen mit Chromatin erfolgt durch die Bindung der LEM Domäne an den Barrier-to-autointegration Factor, ein essentielles Protein der Metazoen, das DNA vernetzen kann. Das Säugergenom enthält sieben Gene, die für LEM Proteine kodieren, darunter die gut charakterisierten Proteine Lamina-associated Polypeptide 2 (LAP2), Emerin, MAN1 sowie die LEM domain-containing proteins 1 und 2 (LEMD2, LEM2). Ebenso enthalten Säugerzellen die weniger gut charakterisierten Proteine Ankle1 und Ankle2, die mehrere Ankyrin Motive und eine LEM Domäne enthalten. Das Ziel dieser Studie ist es, das bisher nur wenig charakterisiertes Protein Ankle1 biochemisch zu analysieren. Dabei stellte sich heraus, dass Ankle1 in Bezug auf seine zelluläre Lokalisation, seine Domänenstruktur und seine katalytische Aktivität ein einzigartiges Mitglied der Familie der LEM Proteine darstellt. Ankle1 ist ein im Verlauf der Evolution konserviertes, nicht membrangebundenes Protein der Metazoen, das eine GIY-YIG Endonuklease Domäne enthält, die chatakteristisch für eine Untergruppe der „Homing“ Endonuklease Superfamilie ist. In Säugerzellen ist Ankle1 sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma zu finden, wobei es in kultivierten Zellen vornehmlich eine zytoplasmatische Lokalisation zeigt. Wir konnten sowohl funktionelle Kernexport- wie auch Kernimportsignale identifizieren, die den Kernimport und -export von Ankle1 steuern. Eine Leptomyzin-vermittelte Hemmung des Kernexportes resultierte in einer Akkumulation von Ankle1 im Zellkern und induzierte DNA Doppelstrangbrüche, deren Bildung von der GIY-YIG und LEM Domäne abhängig war. Die einzig weitere bekannte GIY-YIG Endonuclease in Säugerzellen ist Slx1, ein Protein das in die Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen involviert ist und sogennante Holliday Junctions auflösen kann. Daher vermuteten wir, dass Ankle1 eine ähnliche Funktion hat und untersuchten die räumliche und zeitliche Dynamik des Proteins während des Zellzyklus und nach Induktion von DNA Doppelstrangbrüchen. Es stellte sich heraus, dass die Dynamik von Ankle1 auch durch induzierte DNA Brüche verändert wird, und dass Ankle1-defiziente Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen keine vermehrte Sensivität gegenüber DNA Schäden-induzierenden Agenzien zeigten. Mittels „biotinylation-based proxymity assays“ konnten wir verschiedene, funktionell unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner von Ankle1 auf Proteom-weitem Level identifizieren. Darunter befanden sich auch einige Proteine, die bereits zuvor mit der Reparatur von DNA Schäden in Zusammenhang gebracht wurden. Zusammenfassend läßt sich sagen, dass unsere Studie die erste umfassende biochemische Charakterisierung von Ankle1 darstellt, welche auf eine mögliche und wahrscheinlich redundante Rolle von Ankle1 in der Reparatur von DNA Schäden hinweist.

Zusammenfassung (Englisch)

The nuclear envelope of eukaryotic cells consists of two membrane bilayers, the inner and outer nuclear membrane, which are perforated by nuclear pores that allow regulated traffic of molecules between the cytoplasm and nucleus. The inner nuclear membrane contains numerous integral transmembrane proteins, which have important functions in dynamic nuclear organization during the cell cycle and differentiation, as well as in chromatin organization and regulation. The LAP-Emerin-MAN1 (LEM) protein family comprises a structurally and functionally heterogeneous group of proteins of the inner nuclear membrane that share a common structural 40-residues long motif, the LEM domain. The LEM domain mediates the interaction of LEM proteins with chromatin by binding to Barrier-to-autointegration factor, an essential metazoan DNA-crosslinking protein. The mammalian genome contains seven genes encoding LEM domain-containing proteins, including the well-characterized inner nuclear membrane proteins lamina-associated polypeptide 2 (LAP2), emerin and MAN1, LEM domain-containing proteins 1 and 2 (LEMD1, LEM2) and the poorly characterized Ankyrin repeats and LEM domain-containing proteins 1 and 2 (Ankle1 and Ankle2). In this study, we focused on the biochemical analysis of the hitherto uncharacterized protein Ankle1 and found that the Ankle1 represents a unique member of the LEM protein family in view of its cellular localization, domain organization and catalytic activity. Ankle1 is an evolutionary conserved non-membrane-bound metazoan protein that contains a GIY-YIG-type endonuclease domain characteristic for a subgroup of the homing endonuclease superfamily. In mammalian cells, Ankle1 shuttles between the nucleus and cytoplasm, but showed a predominantly cytoplasmic localization in cultured cells. We identified functional canonical nuclear export and nuclear import signals mediating Ankle1s nucleo-cytoplasmic shuttling. Leptomycin-mediated inhibition of nuclear export causes accumulation of Ankle1 in the nucleus and induces DNA cleavage dependent on the presence of the GIY-YIG and LEM domains. As Slx1, a Holliday junction processing resolvase involved in DNA double strand break repair, represents the only other GIY-YIG endonuclease in the mammalian genome, we hypothesized that Ankle1 may have similar function and analyzed its spatio-temporal dynamics during the cell cycle and upon induction of DNA damage. However Ankle1s dynamic behavior was not affected upon DNA damage, and Ankle1-deficient cells did not show increased sensitivity to DNA damaging agents compared to control cells. Using biotinylation-based proximity assays we identified potential Ankle1-binding partners on a proteome-wide scale and found a functionally diverse set of proteins, including a few candidates previously implicated in DNA damage response pathways. Overall our study provides the first biochemical characterization of Ankle1, indicating a potential and likely redundant role of Ankle1 in DNA damage repair.