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Bibliographic Metadata

Title
Functional biology of multispecific ATP-driven drug efflux transporters / submitted by Zahida Parveen
Additional Titles
Functional biology of multispecific ATP-driven drug efflux transporters
AuthorParveen, Zahida
CensorChiba, Peter
Published2011
Description131 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2011
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)ABC-Transporter / P-Glycoprotein / Arzneistoffmultiresistenz / Arzneistoffinteraktion
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-2595 Persistent Identifier (URN)
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 The work is publicly available
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Functional biology of multispecific ATP-driven drug efflux transporters [4.4 mb]
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Abstract (English)

ABC transporters are ATP binding cassette proteins which play an important role in pharmacokinetics of drugs. P-glycoprotein (P-gp, ABCB1) belongs to the ABCB subfamily. It recognizes a large number of structurally diverse xenotoxic compounds and exports them out of the cell, thereby protecting cells from their lethal effects. Many natural product drugs are used in the treatment of human disease and therefore expression of P-gp is able to elicit a multidrug resistant phenotype. It also plays an important role in drug disposition. The mechanism of substrate binding and transport remains unresolved. The present study was conducted to better understand how drugs are translocated by P-gp.

The membrane spanning portion of P-gp lacks charged residues. The fact that P-gp arose from a homodimeric and rotationally symmetric ancestor by gene duplication made us consider that pseudosymmetry would have been retained and solute might interact with it in a dual mode. In order to support this hypothesis, pseudosymmetric glutamine residues in helices 2 and 8 were mutated to positively charged arginine residues. The underlying idea was that positively charged ligands would be affected by this mutation, while uncharged compounds would not. In order to detect a potential (undesired) interaction of these residues with ligands, glutamines were also changed to neutral alanine residues. Transport and inhibition assays indicated that these residues are not direct interaction partners. In addition rhodamine123 prefers one path (translocation path 1, TP1), while positively charged propafenone analogues, verapamil and vinblastine prefer the other (translocation path 2, TP2). The major conclusion from these experiments is the existence of two (pseudo)symmetric drug translocation pathways, which reflect the transporter's evolutionary origin from a homodimeric ancestor. These paths are preferentially, but not exclusively used by solutes. Because of the fact that H-bonding interactions have been shown in the past to be important for P-gp solute interactions and tyrosines often represent major small molecule interaction partners, we further investigated the role of the two tyrosine residues Y307 and Y310 in translocation path 1. The reason for choosing TP1 as compared to TP2 was the lower number of tyrosine residues (2 vs. 6). Both tyrosines were mutated to phenylalanine either individually or together to probe into H-bonding rather than aromatic interactions. The mutations were also done in Q132R and Q773R background to direct positively charged ligands to use one of the translocation paths exclusively. A significant decrease in rhodamine123 efflux was observed in the double tyrosine mutant (Y307F.Y310F), as well as the triple mutant Y307F.Y310F.Q132R.

This indicates that hydrogen bonds are formed between tyrosines and rhodamine123. In contrast, the interaction with propafenone analogues is not affected. For the first time to our knowledge, the concept of dual translocation paths allowed studying and understanding the role of individual amino acid residues of P-gp for solute interaction. This thesis also describes the discovery of novel chalcone derivatives with strong P-gp inhibitory activity, which contains a core structure related to the phenylpropiophenone moiety of propafenones. Some of these planar compounds are more active than the most active propafenones and show a biological activity which is comparable to that of third generation P-gp inhibitors.

Abstract (German)

Die ABC Transporter sind eine Familie von ABC-Proteinen, deren gemeinsames Merkmal eine ATP-bindende Kassette ist. Einige dieser Transporter sind multi-spezifisch und spielen eine wichtige Rolle für das pharmkokinetische Verhalten von Arzneistoffen. P-Glykoprotein (P-gp, ABCB1) gehört zur ABCB Unterfamilie. P-gp transportiert eine Vielzahl von strukturell unterschiedlichen Xenotoxinen, sowie physiologischen Verbindungen und exportiert diese aus der Zelle. Eine wesentliche Rolle von P-gp ist daher der Schutz von Zellen vor Umweltgiften. Da viele Arzneistoffe natürlichen Ursprungs oder von natürlichen Substanzen abgeleitet sind, kann die Expression von P-gp zu einem Resistenz-Phänotyp gegenüber diesen Substanzen führen, der als multiresistenter Phänotyp (engl. "multidrug resistant phenotype") bezeichnet wird. Der Mechanismus der Bindung der Substrate an das Protein und der anschließende Transport aus der Zelle sind trotz intensiver Untersuchungen nicht klar definiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein besseres Verständnis darüber zu erhalten, wie P-gp Arzneistoffe aus der Zelle exportiert. Die Transmembran-Domänen von P-gp enthalten keine geladenen Aminosäuren. P-gp ein sogenannter Volltransporter, der evolutionär aus einem Halbtransporter entstanden ist. Die Homodimerisierung von Halbtransportern ist für die Funktion erforderlich. Die Entstehung von P-gp aus einem Halbtrransporter hat die Hypothese begründet, dass auch im Volltransporter eine Symmetrie erhalten ist, die einen dualen Interaktionsmechanismus mit Substraten begründet. Um diese Hypothese zu bestätigen wurden symmetrische Glutaminreste in Helix 2 und 8 mittels stellenspezifischer Punktmutation durch positiv geladene Argininreste ersetzt. Die zugrunde liegende Idee war, dass positiv geladene Liganden durch Ladungsabstoßung von diesen Mutationen beeinflusst würden, während ungeladene Liganden nicht beeinträchtigt wären. Um eine mögliche direkte, nicht erwünschte Interaktion zwischen den Argininresten und den Liganden auszuschließen, wurden die Glutaminreste auch durch neutrale Alaninreste ersetzt.

Dadurch konnte gezeigt werden, dass es sich bei den mutierten Glutaminresten nicht um direkte Interaktionspartner handelt. Nicht geladene Liganden wurden durch die Mutation zu Alanin oder Arginin nicht beeinflusst. Diese Kontrollexperimente waren in der Lage eine unveränderte Molekularmechanik des mutierten Transporters zu bestätigen.

Die Daten zeigen eine Präferenz von Rhodamin123 für einen der Translokationspfade (in der Folge Translokationspfad 1, TP1 genannt), während positiv geladene Propafenon-Analoga, Verapamil und Vinblastin den anderen (Translokationspfad 2, TP2) bevorzugen. Es wurde daher zweifelsfrei die Existenz von zwei (pseudo)symmetrischen Transportwegen für Arzneistoffe nachgewiesen. Diese Dualität reflektiert den evolutionären Ursprung des Transporters aus einem homodimeren Vorfahren.

Einer dieser Translokationspfade wird von Substraten bevorzugt, aber nicht ausschließlich, benutzt. Aufgrund der Tatsache, dass Wasserstoffbrücken eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen P-gp und seinen Substraten spielen und Tyrosinreste oft diese Rolle als Interaktionspartner innehaben, wurden des Weiteren die Tyrosinreste Y307 und Y310 im Translokationspfad 1 untersucht. Der Grund für die Wahl von TP1 lag in deren geringerer Anzahl von Tyrosinresten begründet (2 in TP 1 gegenüber 6 in TP 2). Beide Tyrosinreste wurden jeweils zu Phenylalanin mutiert. Auch eine Doppelmutante wurde hergestellt. Die Doppelmutante (Y307F.Y310F) und die Doppelmutante im Q132R Hintergrund zeigten eine signifikante Abnahme der Efflux Rate von Rhodamin123. Dies deutet auf die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen den Tyrosinresten und Rhodamin123 hin. Da Einzelmutanten gegenüber dem Wildtyp keine erniedrigte Transportrate zeigten, sind diese beiden Reste in der Lage, einander zu ersetzen. Eine Interaktion der Tyrosine mit Propafenon-Analoga konnte nicht nachgewiesen werden. Das neue Konzept der dualen Translokationspfade ermöglicht, wie oben beschrieben, die Untersuchung einzelner Aminosäuren in jedem der beiden und erlaubt es, die Rolle dieser Aminowäurereste für die Interaktion zwischen P-gp und seinen Substraten in besserer Weise zu verstehen. Des Weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit auch neue Chalconderivate mit starker inhibitorischer Wirkung vorgestellt. Diese Derivate verfügen über eine chemische Kernstruktur, die der Phenylpropiophenonsubstruktur der Propafenone ähnelt. Einige dieser Chalcone sind aktiver als die aktivsten Propafenone. Sie zeigen eine biologische Aktivität, die mit P-gp-Inhibitoren der dritten Generation vergleichbar sind.

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