Titelaufnahme

Titel
Investigation of the transcription factor ERG and its isoforms / submitted by Naila Malkani
Verfasser / VerfasserinMalkani, Naila
Begutachter / BegutachterinSchmid, Johannes
Erschienen2014
UmfangXII, 148 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Transkriptionsfaktor / ERG / Isoformen / NFkB / FRET
Schlagwörter (EN)Transcription factor / ERG / isoforms / NFkB / FRET
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-3409 Persistent Identifier (URN)
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Investigation of the transcription factor ERG and its isoforms [16.44 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der Transkriptionsfaktor ERG, ein Mitglied derEts Protein-Familie, spielt eine essenzielle Rolle bei der Differenzierung von Endothelzellen und der Bildung von Blutgefäßen. Die genomische Struktur des ERG Gens deutet auf 30 theoretische Isoformen hin aus denen zumindest fünf Haupt-Proteine gebildet werden: ERG1, 2, 3, 4, und 8. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit haben wir diese Isoformen im Detail untersucht und Unterschiede in der Aminosäure-Sequenz gefunden, die zu einer unterschiedlichen intrazellulären Lokalisation führen. ERG8 wurde hauptsächlich im Cytosol gefunden, während all die anderen getesteten Isoformen zum Großteil im Kern lokalisiert waren. Mithilfe von Laser Mikroskop-Techniken konnten wir zeigen, dass ERG-Moleküle zwischen Kern und Cytosol pendeln. Bioinformatik-Analysen konnten daraufhin eine nukleäre Lokalisationssequenz in den Isoformen 1-4 voraus-sagen, die in ERG8 fehlt. Darüber hinaus konnte auch eine potentielle nukleäre Exportsequenz identifiziert werden, die in allen getesteten Isoformen vorhanden ist, sowie eine zweite Exportsequenz, die nur im ERG8 auftritt. Diese Lokalisationssequenzen konnten mithilfe von Mutanten und der Mikroskopie lebender Zellen verifiziert werden. ERG ist nicht nur in Endothelzellen exprimiert, sondern auch in einer Reihe von Krebszellen.

Es gibt Berichte die darauf hinweisen, dass ERG eine anti-inflammatorische Wirkung in Endothelzellen aufweist, bei der die Aktivität von NF-kappa B reduziert wird, während der gegenteilige Effekt in Prostatakrebszellen zu beobachten ist. Unsere Untersuchungen bestätigten diese Hypothese und implizierten eine Wechselwirkung zwischen ERG und NF-kappa B. Um diesen Aspekt mehr im Detail zu studieren, testeten wir auf eine mögliche Interaktion zwischen ERG und p65-NF-kappa B, einem zentralen Transkriptionsfaktor der Entzündung mithilfe einer speziellen Mikroskop-Technik, bei der ein Fluoreszenz-Resonanz Energietransfer (FRET) visualisiert wird. Damit konnten wir zeigen dass ERG physisch mit NF-kappa B interagiert. Darüber hinaus konnten wir auch nachweisen dass ERG an NF-kappa B-spezifischePromoter-Regionen der DNA binden kann. Diese beiden Phänomene könnten eine Basis für eine funktionelle Kooperativität bilden, die wir auch in Reporter-Gen Analysenbeobachten konnten. Um die biologischen Funktionen von ERG in primären Endothelzellen genauer zu evaluieren wendeten wir lentivirale Gen-Suppressionstechniken an, mithilfe derer wir zeigen konnten, dass endogenes ERG nicht nur die Expression von Entzündungsgenen reduziert, sondern auch jene von CDK4 und Cyclin D1, was darauf hindeutet dass es in diesen Zellen sowohl einen anti-inflammatorischen als auch einen anti-proliferativen Effekt hat. Außerdem konnten wir in zwei unabhängigen Testsystemen, einem sogenannten Scratch-Assay und einem Tube-Formation Assay, einen Einfluss von ERG auf die endotheliale Migration nachweisen. Um die Rolle von ERG im Endothel in vivo studieren zu können designten wir schließlich ein Transgen-DNA-Konstrukt von ERG3 unter der Kontrolle eines Endothelzellen-spezifischen Promoters, das in Maus-Oozyten injiziert wurde. Entsprechend genetisch veränderte Mausstämme sind nun verfügbar und werden in nächster Zukunft genauer untersucht werden.

Zusammenfassung (Englisch)

The transcription factor ERG (Ets-Related Gene) is known to have an essential role for differentiation of endothelial cells and angiogenesis, as it is involved in the regulation of several endothelial specific genes. The genomic structure of the ERG gene implies about 30 theoretical isoforms, from which at least five major protein variants are built: ERG1, 2, 3, 4 and 8. We studied these ERG isoforms in detail and found differences in the amino acid sequences, which lead to striking distinctions in localization pattern. ERG8 localized primarily to the cytosol while all the other tested isoforms were predominantly nuclear. Using microscopy techniques with various laser-bleaching strategies, we could demonstrate that ERG molecules are shuttling between the nucleus and cytoplasm. Bioinformatics analysis predicted a nuclear localization sequence in ERGs 1-4, which is absent in ERG8 and furthermore the existence of one nuclear export sequence in all ERGs as well as a second one only in ERG8. These localization sequences could be confirmed with mutants and live cell laser scanning microscopy. Besides endothelial cells, ERG is also expressed in different variants of cancer. There are several reports suggesting that ERG acts as an anti-inflammatory mediator in endothelial cells, reducing the activity of NF-[kappa]B, while it was reported to have the opposite effect in prostate cancer cells. Our studies confirmed this notion and implied a crosstalk between ERG and NF-[kappa]B. To study this in more detail we tested for a potential interaction between ERG and p65-NF-[kappa]B, a central transcription factor of inflammation using FRET (fluorescence resonance energy transfer) microscopy. We could show that ERG can interact physically with NF-[kappa]B and furthermore, that ERG can bind to NF-[kappa]B target sites on the DNA. This might be the basis for a functional cooperativity that we observed in reporter gene assays. For a further evaluation of biological functions of ERG in primary endothelial cells, we applied lentiviral gene suppression techniques, which demonstrated that endogenous ERG down-regulates inflammatory genes, but also CDK4 and CyclinD1 implying both an anti-inflammatory and an anti-proliferative effect of ERG in these cells. Moreover, scratch assays revealed a significantly reduced migration of endothelial cells after ERG-knockdown, which was also in line with the observation that ERG suppression, resulted in reduced tube formation in matrigel. For a more detailed analysis of the role of ERG in the endothelium in vivo, we designed a transgene DNA construct of ERG3 under the control of an endothelial cell specific promoter, which was injected into mouse oocytes. Transgene positive offsprings are now available and will be analyzed in the future.