Titelaufnahme

Titel
Structural studies of VACV A46 and TBEV NS2B/3 proteins as an approach to elucidate virus-host interactions / submitted by Sofiya Fedosyuk
VerfasserFedosyuk, Sofiya
Begutachter / BegutachterinSkern, Timothy
Erschienen2014
UmfangXXII, 115 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Vaccinia Virus / Protein / Virus-Wirts-Interaktion / TIR Domain / Immunomodulator / X-Ray Struktur / Protein-
Schlagwörter (EN)Vaccinia virus / protein / virus-host interactions / TIR domain / immunomodulator / X-ray structure / protein-protein interactions / Bcl-2-like fold
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5379 Persistent Identifier (URN)
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Structural studies of VACV A46 and TBEV NS2B/3 proteins as an approach to elucidate virus-host interactions [6.36 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Viren sind kleine, parasitische Partikel mit krankheitserregenden Eingeschaften, die mit einem hoch-organisiertem Lebenszyklus ein einziges Ziel verfogeln, nämlich sich in der Wirtszelle zu propagieren. In der angewandten und Grundlagenforschung sind immer die Atomstrukturen von viralen Proteinen, mit sowohl strukturellen und nichtstructurellen Funktionen, erwünscht Forschungszielen. Strukturinformationen über Virusproteine ermöglichten die Entwicklung antiviraler Wirkstoffe, welche die Lebensqualität der Menschen verbessern. Hier zeigen wir die Kristallisierung zweier wichtigen Virusproteine, des Immunmodulatorproteins A46 von Vaccinia Virus (VACV) und der Protease NS2B-NS3 des Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus (FSME-Virus), und die Aufklärung der Atomstruktur und mögliche Funktionalität des VACV A46 Proteins.

Poxviren besitzen einen der kompliziersten Lebenszyklus, fast unabhängig von dem Zellreplikationsmechanismus, und verwenden ausgearbeitete Strategien um den Schutz des infiziertes Organismus zu umgehen. VACV kodiert zahlreiche Proteinen, inklusive A46, um die angeborene Immunantwort des Wirts zu umgehen. Die Aufgabe von A46 ist die Aktivierung von NF-kappaB, welcher einen der wichtigsten Transkriptionsfaktoren für die Synthese entzündlicher und antiviraler Cztokine ist, zu inhibieren. Die Bindungspartner von VACV A46 sind folgende Adaptorproteine der angeboren Immunität: MyD88, MAL/TIRAP, TRIF und TRAM.

In dieser Arbeit zeigen wir die biochemische Characterisierung der volleständigen und N- terminal verkürzten Varianten von A46, die Entwicklung einer in vitro Methode um Protein- Protein Interaktionen mit den TIR Domänen von MyD88, MAL und TRAM zu untersuchen, die Entwicklung einer in vivo Methode um die biologische Funktionalität des verkürzten Konstrukts von A46 zu untersuchen and die Struktur von A46 mit 2 angstrom Auflösung.

Das human-pathogene FSME-Virus hat eine hohe Tendenz, bedrohliche Erkrankungen in den infizierten Menschen hervorzurufen. Obwohl eine Impfung verfügbar ist, stieg die Anzahl an Erkrankungen in den letzten Jahren und es gibt keine geeignete Therapie dagegen. Die einzige Protease des FSME Virus, NS2B-NS3, ist wichtig für die Virusverbreitung und deswegen interessant wichtig für die Entwicklung antiviraler Wirkstoffe.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Kristallisierung des minimalen Fusionkonstrukts der NS2B-NS3 Protease vom FSME Virus, welches notwendig für die proteolytische Funktion ist, im Komplex mit dem unspezifischen Inhibitor Aprotinin. Diese Kristalle hatten ungenügende Diffraktionsqualität, circa 5-6 angstrom, um die Struktur berechnen zu können. In Zukunft sollten mehr Methoden zum Kristallqualitätsverbesserung getestet werden um die Struktur der Protease zu bestimmen.

Zusammenfassung (Englisch)

Viruses are small parasitic particles with pathogenic propensity and a highly organized life cycle, leading to the single aim of propagation within a host cell.

The atomic structures of viral proteins, possessing both structural and non-structural functions, have always been desired research achievements in basic and applied branches of science. The structural information on viral proteins enables the solution of such practical questions of biomedicine as the development of antiviral drugs, thus directly improving the quality of human life.

Here, we report the crystallization of two important viral targets, vaccinia virus (VACV) immunomodulator protein A46 and tick-borne encephalitis virus (TBEV) protease NS3B-NS3, and the elucidation of the atomic structure and possible functionality of one of them, namely VACV A46.

Poxviruses possess one of the most complicated reproduction life cycles, being almost totally independent of cellular replication machinery and employing refined strategies to evade the defense mechanisms of the infected organism. VACV encodes numerous proteins to interfere with the innate immune response of the host including the A46 protein.

The task of A46 is to inhibit activation of NF-kappaB, an important transcriptional regulator of the synthesis of proinflammatory and antiviral cytokines. The binding partners of VACV A46 include adaptor proteins of the innate immune system such as MyD88, MAL/TIRAP, TRIF and TRAM.

In this work, we report the biochemical characterization of full-length and N-terminally tryncated variants of VACV A46, development of an in vitro protein-protein binding assay to determine its biological functionality towards TIR domains of MyD88, MAL and TRAM, development of the in vivo functional assay to determine the biological functionality of the crystallization- prone truncated construct of A46 and its crystal structure at 2 angstrom resolution. TBEV is a human pathogen with a high tendency to produce life-threatening pathological disease states in infected humans. No therapy is available and, despite the available vaccination, the numbers of disease cases have increased in Europe within last years.

The single virally encoded protease, NS2B-NS3, is crucial for viral propagation and thus is of exceptional importance for the development of antiviral drugs.

In this work, we describe the crystallization of the minimal fusion construct of TBEV NS2B-NS3 protease necessary for the proteolytic activity of the enzyme in complex with the non-specific inhibitor aprotinin. These crystals had, however, an insufficient quality of diffraction, approximately 5-6 angstrom, to provide the solution of structure. In future, a number of techniques should be tested to improve the crystal quality and, subsequently, determine the structure of the protease.