Titelaufnahme

Titel
Etablierung einer Methode zum Einbau von Molekülen zur Stabilisierung von HIF-1-alpha in Kalziumphosphate - eine in vitro Studie / eingereicht von Laleh Nikpour-Nouri
VerfasserNikpour-Nouri, Laleh
Begutachter / BegutachterinGruber, Reinhard
Erschienen2012
Umfang64 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Dipl.-Arb., 2012
Anmerkung
Zusammenfassung in engl. Sprache
SpracheDeutsch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)Zahnimplantate / Implantatoberflächebeschichtung / Knochenaufbaumaterialien / Hydroxylapatit / Small Molekules / Vascular Endothelial Growth Faktor / HIF 1 Alpha / Gefäßneubildung / Knochenregeneration / Fibringerüst
Schlagwörter (EN)dental implants / implant surface coating / bone graft materials / Hydroxyapatite / small molecules / Vascular Endothelial Growth Factor / HIF-1 alpha / angiogenesis / bone regeneration / fibrin
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-2210 Persistent Identifier (URN)
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Etablierung einer Methode zum Einbau von Molekülen zur Stabilisierung von HIF-1-alpha in Kalziumphosphate - eine in vitro Studie [1.67 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Hintergrund und Zielsetzung: Angiogenese ist essentiell für die Wundheilung und die Knochenregeneration. Verminderte Gefäßneubildung wirkt sich bei Diabetes Mellitus, Rauchern und älteren Patienten nachteilig auf die Gefäßneubildung aus. Angiogenese wird über Hypoxie reguliert. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors HIF-1 alpha spielt dabei eine wichtige Rolle. Die Freisetzung der Angiogenese-fördernden Faktoren (z.B. VEGF) aus Zellen ist die Antwort auf die Aktivierung von HIF-1 alpha. Therapeutisch kann HIF-1 alpha mittels small molecules - wie DFO, DMOG, L-Mimosin und CoCl2 stabilisiert werden. Eine mögliche therapeutische Anwendung wäre small molecules in Oberflächenbeschichtigungen z.B. Kalziumphosphat einzubauen und durch deren Freisetzung die Wundheilung und Knochenregeneration zu fördern. Es ist nicht bekannt, ob small molecules in Kalziumphosphat eingebaut werden können, und wenn ja, wie die Freisetzungskinetik charakterisiert ist. Ziel dieser Arbeit ist der Versuch small molecules in neu-gebildetes Kalziumphosphat einzubauen und die Freisetzung mittels Bioassay mit oralen Fibroblasten zu untersuchen.

Methodik: Um dieses Ziel zu erreichen wurden Gewebekulturplatten mit Kalziumphosphat beschichtet, wobei gleichzeitig verschiedene Konzentrationen von small molecules zugesetzt werden. Wir untersuchten direkte und indirekte Effekte der freigesetzten small molecules auf Fibroblasten der Gingiva sowie Zellen des parodontalen Ligaments. Zur Untersuchung der direkten Effekte wurden orale Fibroblasten auf beschichteten Platten für 24 Stunden kultiviert und anschließend analysiert. Zur Untersuchung der indirekten Effekte wurden die beschichteten Platten für 24 und 48 Stunden mit Medium inkubiert. Das Medium enthält die freigesetzten small molecules. Damit wurden in einem zweiten Schritt die oralen Fibroblasten für 24 Stunden kultiviert und danach analysiert. Primär wird die Freisetzung von VEGF mittels Immunassay analysiert. Zudem wurden Untersuchungen zur Proliferation, Vitalität und Proteinsynthese der oralen Fibroblasten durchgeführt. In einem weiteren Experiment wurden Gewebekulturplatten mit Fibrin beschichtet und small molecules zugesetzt. Durch zwei verschiedene Methoden, Freisetzung und Auswasch, wurden Überstände innerhalb 1, 3, 6 und 24 Stunden gewonnen. Orale Fibroblasten wurden mit Überständen für 24 Stunden kultiviert und danach analysiert. Die VEGF-Freisetzung wurde mittels Immunassay analysiert. Vitalität, Proliferation und Proteinsynthese der oralen Fibroblasten wurden untersucht.

Ergebnisse: In direkter Methode bei CaP Beschichtung zeigte sich eine Tendenz zur Steigerung der VEGF-Produktion, welche jedoch nicht signifikant war. In indirekter Methode bei CaP Beschichtung kam es zu einer signifikanten Steigerung der VEGF-Produktion, während die Vitalität, Proliferation und Proteinsynthese nicht stark beeinflusst wurden. Freisetzung Methode mit Fibrin Beschichtung zeigte - trotz Verminderung in MTT, Leucin und [3H] Thymidin Versuche mit small molecules - Steigerung der VEGF-Produktion. Auswasch Methode mit Fibrinbeschichtung zeigte eine signifikanten Steigerung der VEGF-Produktion. Die Vitalität und Proliferation wurden nicht signifikant beeinflusst. VEGF wird bei niedrigen small molecules Konzentration erhöht freigesetzt. Für die statistische Auswertung der Daten sollten die Versuche öfters wiederholt werden.

Schlussfolgerung: Indirekte Methode mit CaP Beschichtung, Freisetzung und Auswasch Methode mit Fibrin Beschichtung wirken positiv auf VEGF-Produktion. Um eine therapeutische Anwendung von Implantatoberflächebeschichtung mit small molecules zu ermöglichen sind weitere präklinische Studien nötig.

Zusammenfassung (Englisch)

Background and Objective:

Angiogenesis, the formation of new vessels, is essential for wound healing and bone regeneration. Decreased angiogenesis affects of diabetes mellitus, smokers and elderly patients, adverse effect on neovascularization. Angiogenesis is regulated by hypoxia. The activation of the transcription factor HIF-1 alpha plays an important role. The release of angiogenesis-promoting factors (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) in cells is the response to the activation of HIF-1 alpha.

HIF-1 alpha can be therapeutic stabilized by Small molecules - such as DFO, DMOG, L-mimosine and CoCl2, and thus the formation of new vessels may be induced. One possible therapeutic application would be to incorporate the small molecules into the surface coating such as Calcium phosphates and promote wound healing and bone regeneration through their release. It is not known whether small molecules can be incorporated into calcium phosphates, and if so, how the release kinetics is characterized.

The aim of this work is to incorporate the small molecules in newly-formed calcium phosphates and to investigate the release by means of bioassay with oral fibroblasts.

Methodology:

In order to achieve this target, tissue culture plates were coated with calcium phosphate and various concentrations of small molecules were added simultaneously. We investigate direct and indirect effects of the released small molecules on gingival fibroblasts and periodontal ligament cells. To investigate the direct effects in direct method, oral fibroblasts were cultured on the coated plates for 24 hours and then analyzed. To study the indirect effects, the coated plates were for 24 and 48 hours with medium incubated. The medium contained the released small molecules. Thus, in a second step, the oral fibroblasts were cultured for 24 hours and then analyzed. The release of VEGF was primarily analyzed by immunoassay. Additionally, the proliferation, viability and protein synthesis of oral fibroblasts were measured. In a further experiment, tissue culture plates were coated with fibrin and small molecules added. By two different methods, release and washout were supernatants after 1, 3, 6 and 24 hours gathered. Oral fibroblasts were cultured for 24 hours and then analyzed. The release of VEGF was analyzed by immuno-assay. Vitality, proliferation and protein synthesis of oral fibroblasts were also measured.

Results:

Direct method of CaP coating showed tendency to increase VEGF production, which were not significant. Indirect method, CaP coating resulted a significant increase in VEGF production, while the viability, proliferation and protein synthesis were not large influenced. Release method, fibrin coating showed despite reduction in MTT,[3H]leucine and [3H]thymidine experiments with small molecules significant rise of VEGF production. Washout method, fibrin coating showed a significant increase in VEGF production. The vitality and proliferation were not significantly affected. The increased VEGF released at low concentration of small molecules. For statistical evaluation of data, tests should be repeated several times Conclusion: The indirect method of CaP coating and release and washout method in fibrin coating have a positive effect on VEGF production. Further preclinical studies are needed in order to allow a therapeutic application of implant surface coating with small molecules.