Titelaufnahme

Titel
3,3,4,4,5,5-Hexahydroxystilbene impairs melanoma progression in a metastatic mouse model / submitted by Verena Paulitschke
Verfasser / VerfasserinPaulitschke, Verena
Begutachter / BegutachterinKunstfeld, Rainer
Erschienen2010
Umfang150, 12 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Melanom / rationale Therapiekonzepte / metastasierendes Mausmodell / Proteomics / Sekretomanalysen / DNA- Repair / Biomarker / Tumor Mikroenvironment / Resveratrol Derivat / M8
Schlagwörter (EN)melanoma/ rational therapeutic concepts / metastatic SCID mouse model / proteomics / secretome analysis / DNA-repair / biomarker / tumor microenvironment / resveratrol derivative / M8
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-334 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
3,3,4,4,5,5-Hexahydroxystilbene impairs melanoma progression in a metastatic mouse model [22.98 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Das Melanom neigt dazu, früh Metastasen über Lymph- und Blutbahnen auszubilden. Etwa 2/3 aller Erstmetastasierungen sind zunächst auf das regionäre Lymphabflussgebiet beschränkt. Bei Fernmetastasierung ist die Prognose zumeist infaust, die mediane Überlebenszeit ohne Behandlung beträgt nur 6-9 Monate. Aus diesem Grund sind neue Therapieoptionen insbesondere beim metastasierenden Melanom von höchster Relevanz. Wir verwendeten ein Derivat des Resveratrols, ein in der Natur vor allem in Weintrauben vorkommendes Polyphenol, das chemisch durch drei Hydroxylgruppen charakterisiert ist. Für Resveratrol ist seit längerem eine anti-neoplastische Wirkung auf Tumorzellinien beschrieben. Um diesen Effekt zu steigern, wurden Resveratrol-Derivate synthetisiert und ihre Effekte auf unterschiedlichen Tumorzellen untersucht. Dabei hat sich das insgesamt sechs Hydroxylgruppen tragende Resveratrol Derivat M8 (3,3,4,4,5,5-hexahydroxystilbene) als überaus wirksam auf Melanomzellen erwiesen, da es signifikant stärker die Proliferation der metastasierenden, humanen Melanomzelllinie M24met sowie einer Vielzahl von primären Melanomzellen in vitro unterdrückt als Resveratrol. Zur Analyse des Wirkmechanismus von M8 wendeten wir eine Vielzahl von Analysesystemen an. M8 führte in FACS Analysen zu einer Arretierung in der G2/M Phase vergesellschaftet mit einer dosis- und zeitabhängigen Induktion von p21 sowie auch zur Apoptose. In Übereinstimmung mit diesen Daten detektierten wir mittels Westernblot Analysen eine M8 mediierte Induktion von phosphoryliertem p53. Dieses Tumorsuppressorgen ist über die transkriptionelle Aktivierung von einer Vielzahl von Proteinen in der Lage, den Zellzyklus zu regulieren sowie Apoptose oder aber auch DNA Schaden zu induzieren. Passend dazu konnten wir M8 vermittelte Induktion des Reparatursystems (MSH6, MSH2, MLH1) nachweisen, welches bei vorliegenden DNA Schäden über p53 aktiviert wird. Im Cometen-Assay konnte dann der M8 mediierte DNA Schaden verifiziert werden. Mittels eines Zellmigrationsassays detektierten wir zudem eine M8 induzierte Blockade der Tumorzellmigration. Um die zugrundeliegenden Mechanismen zu analysieren, führten wir Proteomanalysen mehrerer Melanomzelllinien in vitro durch. Für diese Analyse griffen wir auf eine völlig neu etablierte Strategie zurück. Wir analysierten systematisch das Profil der zytoplasmatischen Proteine sowie die Sekretionsleistung der Melanomzellen mittels Massenspektrometrie ("shotgun proteomics"). Wir konnten zeigen, dass M8 vor allem jene Proteine reguliert, die in die Migration, Proliferation und Apoptose von Tumorzellen involviert sind.

Insbesondere die relevante Frage der Zellmigration, welche ein notwendiger Schritt zur Metastasierung im Melanom darstellt, konnte wie in dem vorliegenden Schema veranschaulicht, mittels Shotgun-Proteomics aufgeschlüsselt werden. So konnten wir nachweisen, dass M8 sowohl in die amoeboide sowie mesenchymale Zellmigration eingreift über Proteine wie Paxillin, Integrin-linked Protein Kinase oder p21 aktivierte Kinase.

Auch in der 2D Gel Elektrophorese konnte der Befund, dass M8 zu einem DNA Schaden führt, beispielsweise durch die Induktion von Ku70 bestätigt werden. Durch die Verwendung der neu etablierten bioinformatischen Datenbank und die Klassifizierung der zytoplasmatischen, nukleären und sezernierten Proteine konnte ich mögliche neue Biomarker identifizieren.

Basierend auf der Tatsache, dass M8 anti-inflammatorisch wirkt, könnten konstitutiv expremierte Proteine als mögliche prediktive Marker für das therapeutische Ansprechen dienen. Weiters sind Proteine, die durch M8 unterdrückt werden, wie die pro-inflammatorischen Proteine Interleukin-8 oder ADAMTS, Indikatoren für die Sensitivität gegenüber M8 und könnten als pharmakodynamische Marker dienen. Des Weiteren war ich in der Lage zu zeigen, dass M8 eine selektive biomodulatorische Aktivität aufweist, indem es die Proliferation der tumorassoziierten Fibroblasten aber nicht die von normalen Fibroblasten inhibiert.

Die Relevanz des in vitro veranschaulichten Mechanismus konnte in vivo bestätigt werden. So inhibiert M8 signifikant das Tumorwachstum und die Metastasierung zu den lokalen Lymphknoten in unserem spontan metastasierenden, humanen Melanom-Maus Model. Diese umfassende Studie veranschaulicht, dass durch den Einsatz neuer Technologien die Evaluierung und mechanistische Analyse innovativer Therapieansätze ermöglicht wird. Durch das Verständnis des zugrundeliegenden Mechanismus neu designter Wirksubstanzen sowie die genaue Charakterisierung der Tumorzellen könnte es damit in Zukunft möglich sein, rationale Therapiekonzepte im metastasierenden Melanom zu entwickeln

Zusammenfassung (Englisch)

Metastasis in melanoma is associated with poor prognosis. Early detection and new therapeutic designs may thus tremendously improve patient survival. Stilbenes comprise a group of polyphenolic compounds, which exert inhibitory effects on various malignancies. I aimed to evaluate the anti-tumor effects of a novel stilbene derivative - 3,3',4,4',5,5'-hexahydroxystilbene, termed M8 -on human melanoma cells. Cell cycle analysis of the metastatic melanoma cell line M24met showed that M8 treatment induces G2/M arrest accompanied with a dose- and time- dependent upregulation of p21 and downregulation of CDK-2 and leads to apoptosis. M8 induced the expression and phosphorylation of p53 and the expression of proteins involved in the mismatch repair machinery (MSH6, MSH2, MLH1) and a robust tail moment in a comet assay. Additionally, M8 inhibited cell migration in matrigel assays. Shot gun proteomics and Western analysis demonstrated the regulation amongst others of paxillin, integrin-linked protein kinase, p21- activated kinase and ROCK1 indicating that M8 inhibits mesenchymal and amoeboid cell migration. In 2D-electrophoresis I was able to confirm that M8 leads to DNA damage accompanied with a robust upregulation of Ku70, to an induction of apoptosis, an inhibition of cell migration, of tumor progression and metastasis since important hnRNPs, elongation factor 2 or stress-induced-phosphoprotein 1 were regulated. Proteome profiling by shotgun analysis of cytoplasmic, nuclear and secreted protein fractions in combination with a recently established bioinformatic tool chain allowed me to identify possible biomarkers by classification of the cytoplasmatic, nuclear and secreted proteins the M24met melanoma cell line. Since M8 exhibits anti-inflammatory activities, constitutivelly expressed inflammatory proteins in M24met melanoma cell line might serve as perdictive markers for therapeutic response. Intriguingly, the M8 inhibited pro-inflammtory proteins such as interleukin-8 or ADAMTS-1 may be established as indicators for the sensitivity of the melanoma cells and might serve as pharmacodynamic biomarkers to monitor the response to M8 treatment. In addition I was able to demonstrate that M8 selectively influence the microenvironment, since tumor associated fibroblast proliferation was inhibited but not proliferation of normal human fibroblasts. Therefore M8 exerts also biomodulatory activity. Identification of cancer biomarkers in addition to resistance markers and analysis of microenvironment dependent pathomechanisms will support the development of novel therapeutic strategies and to identify the most efficient treatment combinations.

These in vitro data were confirmed in vivo in a metastatic human melanoma SCID mouse model. I demonstrated that M8 significantly impairs tumor growth. M8 also interfered with the metastatic process, since M8 treatment prevented the metastatic spread of melanoma cells to distant lymph nodes in vivo. In summary M8 exerts strong anti-tumor effects with the potential to become a new drug for the treatment of metastatic melanoma.