Titelaufnahme

Titel
The role of PEPCK-M in glucose homeostasis / by Romana Stark
VerfasserStark, Romana
Begutachter / BegutachterinStulnig, Thomas/ Boehm, Stefan
Erschienen2011
Umfang166 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2011
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Mitochondrialer Stoffwechsel / Phosphoenolpyruvat Carboxykinase / Glukose-stimulierte Insulinsekretion / Glukoneogenese
Schlagwörter (EN)Mitochondrial metabolism / phosphoenolpyruvate carboxykinase / glucose-stimulated insulin secretion / gluconeogenesis
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5811 Persistent Identifier (URN)
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The role of PEPCK-M in glucose homeostasis [2.82 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Hintergrund: Wenn der Blutglukosespiegel ansteigt, wird Insulin aus der Bauchspeicheldrüse ausgeschüttet und macht so Glukose für die Zellen verfügbar. Der Blutglukosespiegel hängt von drei Faktoren ab:

Resorption aus Darm nach der Nahrungsaufnahme, Glukoneogenese (die Synthese von "neuen" Glukosemolekülen in Leber und Niere) und Glykogenolyse (Abbau von Stärke, Glykogen, zu Glukose in Leber und Muskel). Das GTP-abhängige Enzym, Phosphoenolpyruvat Carboxykinase (PEPCK), ermöglicht die Bildung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und ist so das Schlüsselenzym für die Glukoneogenese and Glyceroneogenese (die Produktion von "neuen" Glycerolmolekülen, die für die Veresterung von freien Fettsäuren zu Neutralfett, Triglyceriden, benötigt werden).

Weniger bekannt ist, dass zwei PEPCK Formen existieren, eine zytosolische (PEPCK-C) und eine mitochondriale (PEPCK-M) Form. Während die Eigenschaften und die Regulation von PEPCK-C bereits intensiv untersucht wurden, war die metabolische Funktion von PEPCK-M bisher unklar.

Hypothese: Im Gegensatz zu PEPCK-C, deren Transkription durch Insulin stark gehemmt wird, postulieren wir, dass PEPCK-M im Gegensatz dazu immer exprimiert wird und durch Substratverfügbarkeit und mitochondrialem GTP (mtGTP) reguliert wird. MtGTP wird durch Succinyl-CoA Synthetase gebildet und dient als Sensor für die Aktivität des Krebszyklus. Dieser Energie-sensitive mitochondriale Stoffwechselweg ist an der Glukosehomöostase beteiligt.

Methode: Zur Untersuchung der Rolle von PEPCK-M im Glukosestoffwechel wurde PEPCK-M mittels siRNA in INS-1 832/13 Zellen und primäre Hepatozyten sowie mittels Antisense Oligonukleotiden (ASO) in Sprague Dawley Ratten herunterreguliert. Die Insulinsekretion wurde in INS-1 Zellen und die Gluconeogenese in Hepatozyten gemessen. Der PEPCK-M Stoffwechselweg wurde mit Hilfe einer neuentwickelten Strategie analysiert, wobei Stoffwechselprodukte mit 13C markiert und in einem Massenspektrometer gemessen wurden. Mit ASO behandelte Ratten wurden unter Bedingungen eines euglycämischen-hyperinsulinämischen Clamp-Tests sowie nach 36 Stunden Fasten untersucht.

Ergebnisse: Wir haben mRNA, Protein und Aktivität von PEPCK-M in INS-1 Zellen und in Langerhans'schen Inselzellen der Ratte und Maus bestätigt.

PEPCK-C war in diesen Zellen nicht nachweisbar. Mit unserer neu entwickelten Methode, Stoffwechselprodukte mit 13C zu markieren, zeigten wir, dass PEPCK-M in INS-1 Zellen und Inselzellen substantiell zur PEP Produktion beiträgt. In INS-1 Zellen betrug dieser Anteil 30 % und in Inselzellen der Ratte 41 %. In Gegenwart von Glukose verdreifachte sich der Beitrag von PEPCK-M zur gesamten PEP Produktion. Abschwächung des PEPCK-M Proteins hemmte die Glukose-stimulierte Insulinsekretion, was die zentrale Rolle von PEPCK-M in der mitochondrialen Stoffwechsel-mediierten Insulinsekretion unterstreicht. Desweiteren zeigten wir, dass PEPCK-M in der Leber der Ratte vorkommt und dort wahrscheinlich einen vergleichbaren Stoffwechselweg, die Glukoneogenese, reguliert. Eine Reduktion der PEPCK-M mRNA um 80% resultierte in Hepatozyten in einer von Glukose, Glukagon, oder Insulin unabhängigen Abnahme der Glukoneogenese um 60 %. Zur Bestimmung der Funktion von PEPCK-M in vivo erhielten Ratten eine intraperitoneale Injektion von ASO, um so die PEPCK-M Transkription zu drosseln. So wurde PEPCK-M mRNA um ungefähr 80 % in der Leber, proximalem Tubulus der Niere und weißem Fettgewebe vermindert. In ASO-behandelte Ratten waren Blut-Glukose (159.012.80 vs. 148.573.85 mg/dl, P<0.05) und -Insulin (576 vs. 356 myU/ml, P<0.02) nach Nahrungsaufnahme, nicht aber nach 36 Stunden Fasten reduziert. Der euglykämisch-hyperinsulinämischer Clamp ergab in Ratten mit verminderter PEPCK-M mRNA höhere Insulinsensitivität (Glukoseinfusionsraten: 201 vs. 261 mg/kg/min, P=0.003). Dies konnte nicht durch Unterschiede in der endogenen Glukoseproduktion, Aufnahme in der Muskulatur oder Fettgewebe erklärt werden. Interessanterweise, waren das post-absorptives Leberglykogen um 82 %, Blut-Triglyceride um 42 % und das Gewicht des entfernten Fettpolsters um 25 % niedriger. All dieses lässt auf einen konstitutiven Defekt in der PEP Produktion schließen.

Schlussfolgerung: PEPCK-M spielt eine bedeutende Rolle in der Glukosehomöostase. Substrate des Krebszyklus liefern Energie für mtGTP Synthese und weiters PEP in der mitochondrialen Matrix via PEPCK-M.

Dieser mitochondriale Stoffwechselweg koppelt die Flussrate durch den Krebszyklus mit jener der Anaplerose und triggert Insulinsekretion der [beta]-Zellen der Bauchspeicheldrüse. Ein ähnlicher Mechanismus findet sich in der Leber. Substrate des Krebszyklus werden via PEPCK-M zur Produktion von PEP verwendet, das wiederum der Glukose-Neubildung (Glukoneogenese) und Speicherung als Glykogen dient, beziehungsweise um Glycerol-Neubildung (Glyceroneogenese) und Speicherung als Triglycerid.

Zusammenfassung (Englisch)

Background: The pancreatic [beta]-cell hormone insulin makes glucose available for its cellular uptake and is secreted in response to an increase in plasma glucose. Circulating plasma glucose is derived from three sources: intestinal absorption after food intake, gluconeogenesis (de novo glucose production in liver and kidney) and glycogenolysis (breakdown of glycogen to glucose in liver and muscle).

The GTP-dependent enzyme phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) is the key enzyme that provides phosphoenolpyruvate (PEP) for gluconeogenesis and glyceroneogenesis (de novo glycerol production to store free fatty acids in form of triglycerides). Less known is that there are two isoforms, a cytosolic (PEPCK-C) and a mitochondrial (PEPCK-M) form. Most research focused on the function and regulation of PEPCK-C, and the metabolic role of PEPCK-M has not been established before.

Hypothesis: In contrast to PEPCK-C whose transcription is strongly inhibited by insulin, we hypothesized that PEPCK-M is constitutively expressed and instead regulated in response to fuel supply by mitochondrial GTP (mtGTP) that is made by succinyl-CoA synthetase (SCS-GTP) and is a sensor for TCA flux. This energy sensing mitochondrial pathway is involved in glucose homeostasis.

Methods: To assess the role of PEPCK-M in glucose homeostasis we silenced PEPCK-M in insulin secreting INS-1 832/13 cells as well as primary rat hepatocytes using siRNA and in Sprague Dawley rats using antisense oligonucleotides (ASO). We measured insulin secretion (INS-1 cells), gluconeogenic rates (hepatocytes) and flux via PEPCK-M.

Metabolic flux studies were performed using novel 13C-labeling strategies with analysis by mass spectroscopy. ASO treated rats were studied by euglycemic hyperinsulinemic clamps and a 36-hour fast.

Results: We confirmed the presence of PEPCK-M message, protein and activity in INS-1 cells, rat and mouse islets, whereas PEPCK-C was absent. Novel 13C-labeling strategies in INS-1 cells and islets measured substantial contribution of PEPCK-M to the synthesis of PEP. As high as 30 % of PEP in INS-1 cells and 41 % of PEP in rat islets came from PEPCK-M. The contribution of PEPCK-M to overall PEP synthesis was more than tripled with glucose stimulation. Silencing the PEPCK-M gene inhibited glucose-stimulated insulin secretion underscoring its central role in mitochondrial metabolism-mediated insulin secretion. Moreover, we confirmed the existence of PEPCK-M in rodent liver with a similar signaling III pathway regulating hepatic gluconeogenesis. An 80 % reduction of PEPCK-M mRNA in hepatocytes reduced gluconeogenesis by 60 % regardless of the presence of glucose, glucagon, or insulin. To assess the role of PEPCK-M in vivo rats were intraperitoneally injected with ASO that silenced PEPCK-M gene transcription by 80 % in liver, renal proximal tubules and white adipose tissue. PEPCK-M silenced rats had reduced plasma glucose (159.012.80 vs. 148.573.85 mg/dl, P<0.05) and insulin (576 vs. 356 myU/ml, P<0.02) in the fed state but were equivalent following a 36-hour fast. Euglycemic- hyperinsulinemic clamps identified increased insulin sensitivity when PEPCK-M was silenced (GINF: 201 vs. 261 mg/kg/min, P=0.003) that could not be accounted for by differences in endogenous glucose production nor uptake in the muscle or adipose.

Interestingly, post-absorptive hepatic glycogen was 82 % lower and plasma triglycerides 42 % lower along with a 25% reduction in fat pad mass suggesting a constitutive defect in PEP production.

Conclusion: Our work presented here, support an important role for PEPCK-M in glucose homeostasis. Substrate entry into the TCA cycle provides energy for mtGTP synthesis and further PEP synthesis in the mitochondrial matrix by PEPCK-M. In pancreatic [beta]-cells this mitochondrial metabolic flux pathway couples TCA cycle flux with anaplerotic flux to trigger insulin secretion. Similar in liver adequate substrate entry into the TCA cycle drives PEP production by PEPCK-M, which is then used to generate glucose (gluconeogenesis) to be stored as glycogen or glycerol (glyceroneogenesis) to be used for triglyceride synthesis.