Titelaufnahme

Titel
Molecular characterisation of cytosolic DNA recognition / submitted by Evren Karayel
VerfasserKarayel, Evren
Begutachter / BegutachterinSuperti-Furga, Giulio
Erschienen2011
Umfang96 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)angeborenes Immunsystem / zytosolische DNA / Interferon / Proteomik / DNA rezeptor
Schlagwörter (EN)Innate immunity / cytosolic DNA / interferon / Proteomics / DNA receptor
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-3919 Persistent Identifier (URN)
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Molecular characterisation of cytosolic DNA recognition [3.35 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Erkennung von fremder DNA durch zytosolische Rezeptoren des angeborenen Immunsystems löst die Produktion von Interferon-beta und die anschließende antimikrobielle Antwort aus. Allerdings ist es unklar, ob verschiedene Arten von DNA-Liganden von denselben Rezeptoren erkannt werden und ob sich die daraus resultierende Immunantwort von der durch die endosomalen Toll-like Rezeptoren hervorgerufenen Antwort unterscheidet. Um diese Fragen zu beantworten, haben wir zwei der am häufigsten verwendeten DNA Liganden (die Interferon stimulierende DNA (ISD) und poly(dAdT)) miteinander verglichen und die minimalen Strukturanforderungen für die Stimulation von murinen RAW264.7 Makrophagen ermittelt. Genexpressionssignaturen und Kompetitionsexperimente deuten darauf hin, dass ISD und poly(dAdT) qualitativ nicht voneinander zu unterscheiden sind. Dagegen induzierten CpG-haltige Oligonukleotide, die den TLR9-Signalweg stimulieren, deutlich unterscheidbare Genexpressionsmuster.

Struktur-Funktionsanalysen zeigten, dass eine minimale Länge von zwei spiralförmigen Windungen ausreichend für die ISD-vermittelte IFN-beta Induktion ist, während die Phosphorylierung am 5'-Ende unwesentlich ist.

Insgesamt weisen unsere Daten darauf hin, dass in murinen Makrophagen nur ein zytosolischer DNA-Erkennungsweg vorhanden ist.

Im zweiten Teil der Arbeit haben wir die Identifizierung des für die Typ I-Interferon-Induktion verantwortlichen DNA-Sensors angestrebt. Zu diesem Zweck haben wir den folgenden systematischen Ansatz gewählt:

Zuerst haben wir zytosolische DNA-bindende Proteine in RAW264.7-Zellen und mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) durch Affinitätsreinigung unter Verwendung einer synthetischen DNA (ISD) und Kalbsthymus-DNA als "Köder" eingefangen. Die Eluate aus diesen Reinigungen wurden mittels Massenspektrometrie analysiert und führten zur Identifikation von 1606 potenziellen DNA-bindenden Proteinen. Als nächstes haben wir die Liste der identifizierten Proteine nach bestimmten Kriterien gereiht, und 46 Kandidaten für eine anschließende Loss-of-Function Validierung ausgewählt. Zu diesem Zweck haben wir RAW264.7-Zellen mit sechs shRNAs pro Gen stabil transduziert und die IFN-beta-Produktion nach DNA Stimulation gemessen. Von 46 getesteten DNA-Sensor Kandidaten reduzierten mindestens zehn die IFN-beta Produktion mittels zweier oder mehr shRNAs, was sie zu heißen Kandidaten für den lange gesuchten DNA-Sensor in Makrophagen machte. Diese Kandidaten werden in zukünftigen Experimenten näher erforscht, um ihren Gain-of-Function-Phänotyp, ihre DNA-Bindungsspezifität und ihre Wirkmechanismen zu charakterisieren.

Zusammenfassung (Englisch)

Recognition of foreign DNA by cytosolic innate immune receptors triggers the production of interferon-beta (IFN-beta) and the subsequent antimicrobial response. However, it is unclear whether different types of DNA ligands are recognized by similar receptors and whether the resulting response is distinct from the response brought about by the so-called Toll-like receptors (TLRs) in the endosomes. To address these questions, we compared the two most commonly used types of DNA ligands (Interferon-stimulatory DNA (ISD) and poly(dAdT)) and assessed the minimal structural requirements for stimulatory capacity in RAW264.7 murine macrophage cells. Gene expression signatures and competition experiments suggest that ISD and poly(dAdT) are qualitatively indistinguishable and differ from the CpG-containing oligonucleotides triggering the TLR9 pathway. Structure-activity relationship analyses revealed that a minimal length of two helical turns is sufficient for ISD-mediated IFN-beta induction, while phosphorylation at the 5' end is dispensable. Altogether, our data suggest that in murine macrophages only one major cytosolic DNA recognition pathway is operational.

After characterizing the response in RAW264.7 cells in detail, we aimed at identifying the molecular mechanism and in particular the DNA sensor, responsible for type I interferon induction. For this purpose, we took a systematic approach: First, we captured cytosolic DNA binding proteins from RAW264.7 cells and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by affinity purification using a synthetic DNA (ISD) and Calf thymus DNA as "baits". The eluates from these purifications were analyzed by mass spectrometry and resulted in 1,606 distinct putative DNA binding proteins. Next, we prioritized the list of captured proteins according to certain defined criteria and selected 46 candidates for a subsequent loss-of-function validation. To this end, we stably transduced RAW264.7 cells with six shRNAs per gene and measured the IFN-[beta] levels after DNA stimulation. Out of 46 DNA sensor candidates tested, at least ten reduced the IFN-beta production significantly with two or more shRNAs making them primary candidates for the long-sought-after DNA sensor in macrophages. These candidates will be further validated in future to assess their gain-of-function phenotype, their DNA binding specificity and their mechanisms of action.