Titelaufnahme

Titel
The 2C protein from picornaviruses / submitted by Tomas Sara
Verfasser / VerfasserinSara, Tomas
Begutachter / BegutachterinSkern, Timothy
Erschienen2014
UmfangXIV, 161 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)2C / Picornaviren / zinc finger / meta-structure / Unloesliches Protein
Schlagwörter (EN)2C / picornaviruses / zinc finger / meta-structure / insoluble protein
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5492 Persistent Identifier (URN)
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The 2C protein from picornaviruses [8.01 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Picornaviren sind kleine huellenlose RNA Viren, die mehrere wichtige menschliche und tierische Pathogene beinhalten, wie den Poliovirus, den humanen Rhinovirus, den Hepatitis A Virus und den Maul- und Klauensaeuchevirus. Ein erfolgreicher Kampf gegen diese Viren setzt ein effektives antivirales Medikament voraus, um die haeufig aeusserst spezifischen Impfungen zu komplementieren. Konservierte Regionen des viralen Genoms beinhalten potentielle Zielgene fuer entsprechende antivirale Medikamente. Dabei handelt es sich oft um hochspezifische virale Enzyme. Das picornavirale 2C Protein und seine Vorstufe 2BC sind bisweilen die einzigen unstrukturierten Protein unbekannter Struktur.

Aufklaerung der Struktur des 2C wuerde dessen Funktion und die dahinterstehenden Mechanismen erhellen und notwendige Informationen fuer das Design potentieller antiviraler Medikamente liefern. Kuerzlich wurde gezeigt, dass 2C, eine putative ATP hydrolysierende Helikase, an Membranen und virale RNA bindet. 2C ist Teil des viralen Replikationskomplexes, der in Clustern von Wirtszellmembranvesikeln gefunden werden kann. Die Sequenz des 2C ist eine der am staerksten konservierten Regionen aller Picornaviren und seine Deletion ist fatal fuer den Virus.

Aufgrund der Art seiner physiologischen Umgebung ist das Protein weitestgehend hydrophob und traditionelle rekombinante Technologien scheiterten bisher bei der Produktion ausreichender Mengen des 2C fuer strukturelle Studien. Hier wird eine extensive bioinformatische Analyse praesentiert, um die problematischsten Regionen des Proteins und potentielle strukturelle Domaenen zur Produktionen abgeschnittener Proteinkonstrukte zu identifizieren. Strukturmodelle der zentralen ATPase Domaene, basierend auf dem naechsten Homolog und dem C-terminalen, putativen Zinkfinger werden gezeigt. Eine Reihe von Konstrukten des HRV14 2C wurden hergestellt, um unterschiedliche abgeschnittene und chimaerische Varianten des Proteins zu expremieren.

Extensive Optimierung von Puffern und Aufreinigungsprozaeduren fuehrten zu drei potentiellen Proteinvarianten, die sich fuer strukturelle Studien anbieten. The entfernen von 38 Aminosaeuren am N-Terminus, zusammen mit der Verwendung von Detergentien und imidazolfreien Umgebungen machten das 2C loeslich und stabil fuer einige Zeit. Fusion der abgeschnittenen Version des 2C mit dem C-Terminus des Maltose bindenden Proteins fuehrten zu einem gut loeslichen und stabilen Proteins. Allerdings lies es sich nicht kristallisieren. Die Expression der zentralen ATPase Domaene resultierte in der Expression einen gaenzlich unloeslichen Proteins, welches unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigt und in den nativen Zustand zurueckgefalten werden konnte. Ein kurzes Peptid, das eine putatives Zinkfingermotiv beinhaltet wurde aufgereinigt. Allerdigns scheiterte die Strukturanalyse mittels NMR Spektroskopie. Die Analyse des Zinkgehaltes wies nicht auf spezifische Chelatisierung hin. Obwohl letztenendes keine strukturelle Information ueber das 2C erarbeitet werden konnte, zeigen die erhaltenen Proteinvarianten ausreichend hohe Qualitaet fuer strukturelle Studien.

Zusammenfassung (Englisch)

Picornaviruses are small non-enveloped RNA viruses that contain several important human and animal pathogens, such as poliovirus, human rhinovirus, hepatitis A virus and foot-and-mouth-disease virus. A successful fight with these viruses requires an effective antiviral drug to complement often narrowly specific vaccines. Conserved regions of the viral genome house potential drug targets for the antivirals; these are often highly specific viral enzymes. The picornaviral 2C protein and its precursor 2BC remain the only non-structural proteins with unknown structure. Solving the structure of 2C would elucidate the mechanism of its function and provide information necessary to design potential antiviral drugs. Previously, the 2C, a putative ATP-hydrolyzing helicase, has been shown to bind to membranes as well as the viral RNA.

The 2C is a part of the viral replication complex present in a cluster of host cell membrane vesicles. The sequence of the 2C is one of the most conserved regions among all picornaviruses and its deletion is fatal to the virus.

Due to the nature of its physiological environment, the protein is largely hydrophobic and traditional recombinant technologies have failed so far to produce sufficient amount of 2C for structural studies. Here, an extensive bioinformatic analysis is presented to identify the most problematic regions and potential structural domains for production of truncated protein constructs. Structural models of the central ATPase domain based on the nearest homolog as well as the C-terminal putative zinc finger are shown. A series of constructs of HRV14 2C was prepared to express differentially truncated and chimeric variants of the protein. Extensive buffer and purification procedures optimization yielded three candidate protein variants suitable for structural studies. The removal of 38 amino acids from the N- terminus, together with the use of detergent and imidazole-free environment rendered the 2C soluble and stable for an intermediate period of time. Fusion of the truncated version of the 2C to the C-terminus of maltose binding protein carrier yielded a highly soluble and stable protein that; however, did not yield any crystallization hits. The expression of the central ATPase domain resulted in the expression of completely insoluble protein, which could be purified under denaturing conditions and refolded to native state. A short peptide harboring a putative zinc finger motif was purified; however, the structure determination by NMR has failed; an analysis of the zinc content did not confirm specific chelation. Even though no structural information on the 2C was provided in the end, the obtained protein variants show sufficient quality for further optimization for structural studies.