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Titel
Investigations on the effects of sodium hydrogen sulfide on human fibroblast-like synoviocytes and in two murine models of arthritis / submitted by Daniela Sieghart
Verfasser / VerfasserinSieghart, Daniela
Begutachter / BegutachterinSteiner, Günter
Erschienen2014
UmfangXV, 85 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Hydrogensulfid / synoviale Fibroblasten / experimentelle Arthritismodelle / Entzündung / Signaltransduktion
Schlagwörter (EN)hydrogen sulfide / fibroblast-like synoviocytes / experimental models of arthritis / inflammation / signal transduction
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-3423 Persistent Identifier (URN)
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Investigations on the effects of sodium hydrogen sulfide on human fibroblast-like synoviocytes and in two murine models of arthritis [3.49 mb]
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Zusammenfassung (Englisch)

Hydrogen sulfide (H2S) is a member of the gasotransmitter family and has emerged as a promising agent for resolution of inflammation in different diseases. H2S is frequently applied to patients suffering from osteoarthritis (OA) in form of sulfur bath therapies, but information about its effectiveness is still poor. It was the objective of this study to investigate the effects of H2S on fibroblast-like synoviocytes (FLS), which are key players in OA pathogenesis by responding to pro-inflammatory stimuli such as interleukin (IL)-1ß with excessive production of cytokines and matrix degradating enzymes. Furthermore, this study aimed to investigate the in vivo effects of H2S in two murine models of arthritis. Primary FLS derived from OA patients were used for in vitro experiments. FLS activation was induced by IL-1ß. FLS treated with the exogenous H2S donor sodium hydrogen sulfide (NaHS) were analysed by flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay and quantitative real-time RT-PCR. The activation of several MAPkinases and other serine/threonine kinases was assessed by human proteome profiler array and Western-blotting. Treatment-induced effects on cellular structure and synovial architecture were investigated in 3-dimensional (3-D) extracellular matrix micromasses. Additionally, the in vivo effects of H2S were investigated in two murine arthritis models, collagen-induced arthritis and serum transfer arthritis. NaHS treatment reduced spontaneous and IL-1ß-induced production of IL-6, IL-8 and RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) in different experimental settings and decreased the expression of MMP-2 and MMP-14. IL-1ß stimulation induced the phosphorylation of most MAPkinases. NaHS treatment reduced the IL-1ß-induced MAPK activation in FLS but increased phosphorylation of pro-survival factor Akt. When cultured in spherical micromasses, FLS intentionally established a synovial lining layer-like structure; stimulation with IL-1ß altered the architecture of micromasses leading to hyperplasia of the lining layer which was reverted by exposure to NaHS. In addition, NaHS suppressed IL-1ß-induced upregulation of MMP-2 whereas it stimulated phosphorylation of Akt. Furthermore, in mice with serum transfer arthritis NaHS treatment significantly diminished the number of osteoclasts leading to greatly reduced bone erosion, while the amount of inflammation was only slightly decreased. The data obtained indicate, on the one hand, anti-inflammatory effects of hydrogen sulfide on activated synovial fibroblasts that result from selective manipulation of the MAPK and the PI3K/Akt pathway and on the other hand suggest direct effects on bone metabolism by interfering with osteoclastogenesis.

Zusammenfassung (Deutsch)

Schwefelwasserstoff (Dihydrogensulfid, H2S) gehört zu der Familie der Gasotransmitter und ist in eine Vielzahl biologischer Prozesse involviert. Zudem haben sich H2S freisetzende Verbindungen in verschiedenen Krankheitsmodellen als vielversprechende Kandidaten für einen möglichen therapeutischen Einsatz erwiesen. H2S wird bei der Behandlung von Patienten mit degenerativen und entzündlichen Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, insbesondere Arthrosen, in Form von Schwefelbadtherapien eingesetzt, jedoch ist die bisherige Erkenntnis bezüglich seiner Wirksamkeit begrenzt und wenig über die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen bekannt.

Synoviale Fibroblasten spielen eine wichtige Rolle in der Entstehung der Arthrose wie auch der rheumatoiden Arthritis indem sie auf die Aktivierung durch Entzündungs-induzierende Faktoren wie z.B. Interleukin (IL)-1ß mit der vermehrten Produktion von Zytokinen und Matrix abbauender Enzyme reagieren. Es war daher das primäre Ziel dieser Arbeit, die Effekte von H2S auf synoviale Fibroblasten zu untersuchen.

Ein weiteres Ziel war die Untersuchung möglicher in vivo Effekte der H2S Behandlung an Hand von zwei Tiermodellen der rheumatoiden Arthritis. Für Zellkulturexperimente wurden primäre synoviale Fibroblasten verwendet, welche aus Patienten mit Arthrose im Zuge von Gelenksersatzoperationen gewonnen worden waren. Diese wurden mit IL-1ß aktiviert und mit Natriumhydrogensulfid (NaHS) behandelt, welches in wässriger Lösung H2S freisetzt, und mit Hilfe von Durchflusszytometrie, ELISA und quantitativer Real-Time RT-PCR untersucht. Die Aktivierung verschiedener MAP Kinasen und anderer Serin/Threonin Kinasen wurde mittels Proteom Profiler Array und Western Blot analysiert. Für die Untersuchung möglicher Effekte von NaHS auf Zellstruktur und Gewebearchitektur der synovialen Fibroblasten wurden die Zellen in 3-dimensionalen Kulturen über mehr als 2 Wochen inkubiert. Mögliche Effekte auf die Entwicklung und den Verlauf von entzündlicher, destruierender Arthritis wurden in zwei verschiedenen Mausmodellen untersucht. Eine Behandlung mit NaHS führte zum Rückgang der spontanen sowie der durch IL-1ß-induzierten Produktion von IL-6, IL-8 und RANTES. Zusätzlich wurde die Expression der Matrix-Metalloproteinasen (MMP)-2 und -14 inhibiert. Die Aktivierung von synovialen Fibroblasten durch IL-1ß bewirkte eine deutliche Erhöhung der Phosphorylierung der meisten MAP Kinasen, wohingegen die Phosphorylierung von Akt leicht reduziert wurde. Gleichzeitige Behandlung mit NaHS reduzierte die IL-1ß-induzierte Aktivierung der MAP Kinasen, erhöhte aber deutlich die Phosphorylierung von Akt, welcher ein wichtiger Faktor für das Überleben der Zelle ist. Synoviale Fibroblasten, welche in 3-dimensionalen Kulturen mit IL-1ß stimuliert wurden, zeigten eine Kondensation von Zellen an der Oberfläche, ähnlich der pathologisch erhöhten Anzahl an Zellschichten im Synovium von Patienten mit rheumatoider Arthritis. Diese Zellkondensation konnte durch Behandlung der Kulturen mit NaHS vollständig unterbunden werden.

In den an zwei Arthritis Modellen durchgeführten therapeutischen Studien konnte im Modell der Serumtransfer Arthritis durch Behandlung mit NaHS die erosive Knochenschädigung durch Inhibierung der Osteoklastenaktivierung verhindert werden, wohingegen kein signifikanter Einfluss auf das entzündliche Geschehen festgestellt wurde. Die erhaltenen Daten zeigen, dass Hydrogensulfid die durch IL-1ß induzierte Aktivierung synovialer Fibroblasten hemmen kann, welche auf die Manipulation der MAP Kinasen sowie des PI3K/Akt Signaltransduktionsweges zurückzuführen sind. Weiters legen die Ergebnisse der Tierversuche nahe, dass NaHS einen direkten Einfluss auf die Osteoklastenbildung haben könnte, wodurch vorwiegend die erosive Natur der Arthritis reduziert wird.