Titelaufnahme

Titel
Interaction of protein C inhibitor with phosphatidylserine, exposed on cell membranes, and implications in endocytic and immunological processes. / submitted by Daniela Handschuh
Verfasser / VerfasserinHandschuh, Daniela
Begutachter / BegutachterinGeiger, Margarethe
Erschienen2014
UmfangIX, 105 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Protein C Inhibitor / Phagozytose / Apoptose / Immunologie / Phosphatidylserin / Efferozytose / Serpine
Schlagwörter (EN)Protein C Inhibitor / phagocytosis / apoptosis / immunology / phosphatidylserine / efferocytosis / serpins
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-3328 Persistent Identifier (URN)
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Interaction of protein C inhibitor with phosphatidylserine, exposed on cell membranes, and implications in endocytic and immunological processes. [9.03 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Protein C Inhibitor (PCI) gehört zur Familie der Serinprotease Inhibitoren (Serpine) mit einer beachtlichen Anzahl an Zielproteasen.

Zuerst wurde PCI als Inhibitor des aktivierten Protein C entdeckt. Daher wurde PCI anfangs vorwiegend im Bereich der Blutgerinnung untersucht und bekam aufgrund der Vielzahl an Interaktionspartnern verschieden Rollen sowohl in Blutkoagulation als auch in der Fibrinolyse zugeschrieben.

Mittlerweile hat sich das Forschungsfeld rund um PCI vergrößert und somit wurden auch weitere Zielproteasen außerhalb der Gerinnungskaskade entdeckt und neue Wirkungsweisen und physiologische Funktionen erkannt.

Bindung an Heparin oder Glykosaminoglykane kann die Aktivität von PCI in Bezug auf Proteaseninaktivierung in einigen Fällen deutlich erhöhen. In den letzten Jahren haben Studien mit negativ geladenen Phospholipiden, wie zum Beispiel Phosphatidylserin (PS) oder Phosphatidylethanolamin (PE) ähnliche Einflüsse auf die Aktivität von PCI gezeigt. Das sind gerade die Phospholipide, die in der eukaryotischen Zellmembran vorwiegend an der Innenseite des Lipidbilayers vorkommen und nur unter bestimmten Umständen, wie Zellaktivierung oder Apoptose an der äußeren Zellmembran exponiert werden. Bei der Phagozytose von apoptotischem Material, auch genannt Efferozytose, bekommt PS an der Zelloberfläche eine besondere Signalrolle zugeschrieben. Efferozytose ist ein wichtiger immunologischer Vorgang, der vor allem eine unkontrollierte Ausschüttung von toxischen Zellinhalten, aus beschädigten oder spät apoptotischen Zellen, ins umgebende Gewebe verhindern soll. Im Gegensatz zur Phagozytose von pathogenen Stoffen, verläuft die Efferozytose unter anti-inflammatorischen Bedingungen ab. Eine gestörte Efferozytosefunktion wird mit chronischen Entzündungen, Gewebeschädigungen und Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht.

Aufgrund der Affinität von PCI zu negativ geladenen Phospholipiden war es das Ziel dieser Studie Unterschiede in der Bindung von PCI an Zellen mit unterschiedlichen Lipid-Oberflächen zu untersuchen. Dazu wurde die Bindung von exogen zugegebenem PCI an unbehandelte und apoptotische Zellen verglichen. Die Ergebnisse zeigten die doppelte Menge an PCI gebundenen Zellen bei apoptotischen im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Als nächster Schritt wurde der Einfluss von PCI auf die Efferozytose apoptotischer Partikel mit Hilfe von Zellkultur-Makrophagen (differenzierte U937 Zellen) und apoptotischen Jurkat Zellen untersucht.

Die Ergebnisse zeigten eine Hemmung der Efferozytose von apoptotischen Zellen um ca. 50% bei Zugabe von PCI. Laut einer anderen Studie beeinflusst PCI auch die Phagozytose von Bakterien und daher wurde der Effekt von PCI auf verschiedene Formen der Phagozytose (Aufnahme von Polystyrol-Perlen und Endozytose flüssiger Materialien) untersucht. Die Ergebnisse zu allen untersuchten Phagozytose-Formen zeigten, dass PCI auf Rezeptor-basierte Phagozytose einwirkt und die Auswirkung von der Interaktion mit dem Phagozyten oder mit dem aufzunehmenden Material abhängt. Um den Einfluss von PCI auf Makrophagen weiter zu beleuchten, wurde die Bindung von PCI an Makrophagen auch während der Makrophagendifferenzierung untersucht. Mit zunehmender Differenzierung und PS Exposition konnte auch eine ansteigende Bindung von zugesetztem PCI an die Zellmembran gezeigt werden. Ebenfalls konnte ein Anstieg der PCI Expression sowohl auf RNA- als auch auf Protein- Ebene mit zunehmender Differenzierung beobachtet werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die enorme Vielschichtigkeit verschiedener Phagozytoseformen und unterstreicht ein erst kürzlich entdecktes Wirkungsfeld von PCI im immunologischen Bereich.

Zusammenfassung (Englisch)

Protein C Inhibitor (PCI) is a serine protease inhibitor with reactivity for various proteases. Initially the main functions of PCI were discovered in the field of coagulation, and PCI was first described as an inhibitor of activated protein C (APC). Since then, it has been discovered that PCI is a versatile protein, interfering with many proteases and involved in several diseases. Heparin and glycosaminoglycan binding of PCI has been reported to stimulate the latter`s protease inhibitory activity. More recent findings assigned similar stimulatory effects to negatively charged phospholipids, like phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylserine (PS). This in vitro discovery of an interaction of PCI with phospholipids raised the question of a physiological relevance. PS is usually located on the inner leaflet of the plasma membrane, underlying lipid asymmetry. When apoptosis is induced, cells lose this asymmetry and PS becomes exposed on the cell surface and acts there as an important apoptosis marker and phagocytosis signal. Apoptotic cell removal, also called efferocytosis is an important defense mechanism, protecting from spillage of toxic cell contents from dying cells. A failure of efferocytosis is related to tissue damage, inflammation and autoimmune diseases. The aim of this study was to elucidate possible differences in the binding pattern of exogenously added PCI to cell membranes of different lipid compositions with special interest in PS-exposing lipid bilayers. Binding to live and apoptotic cells was investigated and revealed an obvious preference of PCI for binding to apoptotic cells as judged from FACS analysis showing twice as many PCI binding cells in the apoptotic cell fraction as compared to the live cell fraction. Based on these results demonstrating PCI binding to PS, the influence of PCI on efferocytosis was studied.

Results obtained with tissue culture macrophages (differentiated U937 cells) and apoptotic Jurkat cells, showed inhibition of apoptotic cell removal by 50% in the presence of PCI as compared to the buffer control. Since previous studies revealed an effect of PCI on the phagocytosis of bacteria, I also studied the influence of PCI on the phagocytosis of polysterene microspheres and on fluid phase endocytosis.

Altogether the results elucidated an influence of PCI on receptor-mediated phagocytosis, with different outcomes, depending on whether the solid targets or the phagocytes were exposed to PCI.

Therefore PCI binding was also studied in the course of macrophage differentiation, revealing an increased binding along with PS exposure dependent on the maturation grade. Further, a differentiation dependent increase in PCI expression was observed in macrophages, on mRNA- as well as on protein-level. A first approach to study the physiological relevance of this upregulation is presented in this work. However, this study shows the high complexity of phagocytosis mechanisms and underlines PCI as a protein with functions in inflammation and immunity.