Titelaufnahme

Titel
Endotoxintoleranzentwicklung bei humanen parodontalen Ligamentzellen durch Stimulierung mit Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharid / eingereicht von Alice Blufstein
Weitere Titel
Effect of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide on endotoxin tolerance in human periodontal ligament cells
Verfasser / VerfasserinBlufstein, Alice
Begutachter / BegutachterinAndrukhov, Oleh
ErschienenWien, 2016
Umfang79 Blatt : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Diplomarbeit, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in englischer Sprache
SpracheDeutsch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)Endotoxintoleranz / parodontale Ligamentzellen / Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharid / Parodontitis
Schlagwörter (EN)endotoxin tolerance / periodontal ligament cells / Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide / periodontitis
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-7923 Persistent Identifier (URN)
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Endotoxintoleranzentwicklung bei humanen parodontalen Ligamentzellen durch Stimulierung mit Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharid [1.39 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Parodontitis beschreibt eine multifaktoriell bedingte chronische Erkrankung des Zahnhalteapparates, die zu einer Destruktion von Weichgewebe und Alveolarknochen führt. Einerseits wird diese Gewebezerstörung durch bakterielle Toxine wie die des gramnegativen Anaerobiers Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) verursacht, andererseits spielt auch die Immunantwort des Wirts eine wesentliche Rolle.

Unter Endotoxintoleranz versteht man einen unter anderem von Monozyten/Makrophagen, Lymphozyten und Neutrophilen Granulozyten etablierten Mechanismus. Sind diese Zellen für einen gewissen Zeitraum Endotoxinen wie Lipopolysaccharid (LPS) in einer geringen Konzentration ausgesetzt, kommt es bei erneuter LPS-Belastung in höherer Konzentration zu einer verminderten Expression von Zytokinen. Dadurch wird eine überschießende und ausgedehnte Immunantwort und somit eine stärkere Zerstörung der parodontalen Gewebe verhindert. Studien haben gezeigt, dass humane gingivale Fibroblasten diese Toleranzentwicklung nicht aufweisen und somit durch anhaltende Produktion proinflammatorischer Zytokine eine wichtige Rolle in der Progression der Parodontitis spielen können.

Unerforscht ist bislang die Endotoxintoleranzentwicklung bei parodontalen Ligamentzellen (PDL-Zellen), die eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie aufweisen und ebenfalls in der Lage sind Zytokine zu produzieren.

Zielsetzung: Das Ziel dieser Diplomarbeit bestand darin mithilfe von in vitro Versuchen herauszufinden, ob PDL-Zellen eine Endotoxintoleranz etablieren. Darüber hinaus wurde ein Erkenntnisgewinn über den Einfluss von Toll-like Rezeptor (TLR) 2 und TLR4 auf die Immunreaktion parodontaler Ligamentzellen angestrebt.

Methodik: Primäre humane parodontale Ligamentzellen von fünf verschiednenen Donoren wurden kultiviert und zunächst in einem Vorversuch mit verschiedenen Konzentrationen P. gingivalis LPS stimuliert, um jene Konzentration zu ermitteln, die eine submaximale Immunreaktion der Zellen auslöst. Anschließend wurde im Hauptversuch ein Teil der PDL-Zellen mit P. gingivalis LPS und löslichem CD14 (sCD14) in der ermittelten Konzentration vorstimuliert. Nach 24 Stunden erfolgte nicht nur eine Stimulierung mit P. gingivalis LPS und sCD14 in höherer Konzentration vorstimulierter Zellen, sondern auch LPS-unbelasteter PDL-Zellen zur Schaffung einer Vergleichsmöglichkeit. Desweiteren wurden sie mit Escherichia coli LPS als TLR-4 Agonist, sowie mit dem TLR2-Agonisten PAM3CSK4 stimuliert, um die Wirkung beider Rezeptoren separat beurteilen zu können. Der Nachweis der Genexpression von Interleukin 6, Interleukin 8, Monozyten-cheomataktisches Protein 1 (MCP1), TLR2 und TLR4 erfolgte mittels PCR. Durch ELISA ging die Messung der Proteinexpression aus Überständen von statten.

Resultate: Mithilfe der Vorversuche wurde als submaximale Konzentration für die Vorstimulierung P. gingivalis LPS 100ng/ml unter Zugabe von sCD14 gewählt. Der Hauptversuch ergab weder durch Stimulierung mit P. gingivalis LPS, noch mittels E. coli LPS oder Pam3CSK4 signifikante Unterschiede in der Zytokinexpression zwischen vorstimulierten und nicht-vorstimulierten PDL-Zellen. Desweiteren konnte kein signfikanter Unterschied zwischen Zellen mit und jenen ohne Vorstimulierung bezüglich der Expression von TLR2 festgestellt werden. Lediglich die TLR4-Expression wies eine signifikante Abnahme nach vorangehender Vorstimulierung auf.

Konklusion: Da es bei den vorstimulierten PDL-Zellen nach erneuter Stimulierung zu keiner Abnahme der Expression von IL6, IL8 und MCP1 kam, lässt unsere Studie die Annahme zu, dass humane parodontale Ligamentzellen keine Endotoxintoleranz entwickeln. Eine weitere Erkenntnis war die herabgesetzte Expression von TLR4, der den wichtigsten Rezeptor für Lipopolysaccharide darstellt. Da es zu keiner Abnahme der Zytokinexpression gekommen ist, gibt dies einen Hinweis darauf, dass die TLR4-Expression keinen Einfluss auf die Amplitude der Immunantwort nimmt und diesem Rezeptor eine untergeordnete Rolle im Rahmen der Endotoxintoleranz zugeordnet werden kann.

Zusammenfassung (Englisch)

Periodontitis is a multifactorial chronic disease that affects the tooth supporting tissue and is associated with destruction of soft tissue and alveolar bone loss. The tissue destruction is caused on one hand by bacterial toxins such as that of Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) and on the other hand affected by the host immune response.

Endotoxin tolerance constitutes a mechanism developed in cells like macrophages/monocytes, lymphocytes and neutrophils. The exposure to a low concentration of endotoxins such as lipopolysaccharide leads to a decrease of cytokine expression after subsequent lipopolysaccharide challenge in higher concentration. Hence an excessive immune response will be avoided preventing a severe destruction of the tissue. According to literature gingival human fibroblasts do not induce endotoxin tolerance and due to this fact may play a key role on the severity of tissue destruction and progression of periodontitis by continuous production of proinflamatory cytokines.

So far there is no research about endotoxin tolerance in periodontal ligament cells, which have a fibroblast-like morphology and are also capabale of cytokine production.

Aim: The aim of this thesis was to examine in an in vitro study, if periodontal ligament cells are capable of inducing endotoxin tolerance. Furthermore, the objective was to investigate the influence of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 on the extent of the immune response of periodontal ligament cells.

Material and methods: Human periodontal ligament cells were cultivated from 5 different donors and stimulated with different concentration of P. gingivalis LPS, which was performed in order to determine the LPS concentration that provokes a submaximal immune response. Subsequently a part of the cells were prestimulated with the previously determined concentration of P. gingivalis LPS and CD14. In the next step, after 24 hours the pretreated aswell as untreated PDL-cells were stimulated with P. gingivalis LPS and soluble CD14.

Additionally, a stimulation of cells with a TLR4 agonist Escherichia coli LPS and TLR2 agonist PAM3CSK4 was performed. The detection of gene expression of interleukin 6, interleukin 8, MCP1, TLR2 and TLR4 was carried out by PCR, while the protein production by cells was measured with ELISA.

Results: In the preliminary experiments it was found that a stimulation of PDL cells with P. gingivalis LPS at a concentration of 100ng/ml in the presence of soluble CD14 induces significant submaximal response and this concentration was used for pre-stimulation of PDL cells. In the main trial, in which PDL cells were stimulated with P. gingivalis LPS, E. coli LPS or Pam3CSK4 no significant difference in the cytokine expression between the prestimulated and unstimulated groups was observed. Furthermore, the expression of TLR2 was also not significantly different between the prestimulated and unstimulated PDL cells. In contrast, a significant decrease of the TLR4 expression in the prestimulated PDL cells compared to unstimulated cells was detected.

Conclusion: Since prestimulation of human PDL cells with submaximal concentration of P. gingivalis LPS had no effect on the production of IL6, IL8 and MCP1 by these cells in response to different stimuli, it can be concluded that human periodontal ligament cells do not develope endotoxin tolerance. Lower expression of TLR4 in prestimulated cells was not associated with any changes in the cytokine production, which suggest that TLR4 expression level may play a minor role in endotoxin tolerance. The absence of endotoxin tolerance in periodontal ligament cells suggests that these cells might play an important role in the sustained inflammation during a periodontal disease.