Titelaufnahme

Titel
Introducing two strategies for the reproducible detection of whole membrane and surface proteomes / submitted by Katrin Hörmann
Weitere Titel
Vorstellung zweier Strategien für die reproduzierbare Detektion von Membran- und Zelloberflächenproteomen
Verfasser / VerfasserinHörmann, Katrin
Begutachter / BegutachterinSuperti-Furga, Giulio
ErschienenWien, 2016
UmfangXII, 80 Blatt : Illustrationen
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Univ., Dissertation, 2016
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Proteomik / Membranproteine / Zelloberflächenproteine / Biotinylierung / Massenspektrometrie
Schlagwörter (EN)proteomics / membrane proteins / cell surface proteins / biotinylation / mass spectrometry
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-7681 Persistent Identifier (URN)
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Introducing two strategies for the reproducible detection of whole membrane and surface proteomes [13.99 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Membranproteine sind in ihrer Struktur und Funktion höchst unterschiedlich und Veränderungen in ihrem Expressionsmuster gehören zu den ersten Ereignissen in pathologischen Situationen. Sie sind daher sowohl als Biomarker, als auch als therapeutische Ansatzpunkte interessant. Sie im großen Maßstab mittels Proteomik zu analysieren, war jedoch bisher eine schwierige Aufgabe. Mehrere Protokolle, die entweder alle Membranproteine umfassen, die unter definierten Bedingungen und zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle exprimiert werden, oder auf Proteine an der Plasmamembran zugeschnitten sind, wurden entwickelt. Dennoch stehen vergleichende Analysen kaum zur Verfügung. Die vorliegende Arbeit bietet einen systematischen Vergleich verschiedener Plasmamembranisolierungsstrategien zur nachfolgenden Analyse durch eindimensionale gel-freie Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie. Darüber hinaus wurde das Sulfo-NHS-SS-Biotinylierungsverfahren, das innerhalb der getesteten Kriterien insgesamt am besten abschnitt, durch eine kompetitive Biotin Eluierungsstrategie vereinfacht, die sich als schnell, kosteneffektiv und robust erwies und dadurch eine routinemäßige Evaluierung von Plasmamembran Proteomen in einem größeren Maßstab ermöglicht. Interessanterweise ergab die computergestützte Auswertung verschiedener Datenbanken und Programme zur Vorhersage zellulärer Lokalisationen, dass insgesamt über 90 % der mit der modifizierten Sulfo-NHS-SS-Biotinylierungsmethode identifizierten Proteine mit der Plasmamembran assoziiert sind, überwiegend als Interaktionspartner. Des Weiteren konnte das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Zelloberflächenproteomikverfahren erfolgreich zur Bestimmung von genetischen oder durch Medikamente bedingten Veränderungen in der zellulären Plasmamembranzusammensetzung angewendet werden.

Gleichzeitig wurde Triton X-114 Phasentrennung in Verbindung mit filtergestützter Probenvorbereitung als gleichermaßen reproduzierbares und robustes Protokoll zur ergänzenden Analyse aller Membranproteine etabliert. Insgesamt ermöglichen die hier vorgestellten Ergebnisse nicht nur eine verstärkte routinemäßige Evaluierung von Membran- und Zelloberflächenproteomen, die für den funktionellen Zusammenhang von Transport- und Signalwegen sowie für das Verständnis der Wirkungsweise von Medikamenten relevant sind. Vielmehr erlaubt die Kombination beider Technologien deren gegenseitige Abgrenzung und erhöht so die verfügbare Auflösung dieser Schlüsselproteome.

Zusammenfassung (Englisch)

Membrane proteins are structurally and functionally highly diverse and changes in their expression pattern are among the first events taking place in pathological conditions. Thus, they are a rich source of biomarkers as well as therapeutic targets. Their large-scale analysis using proteomic strategies has, however, been challenging. Several protocols comprising either all membrane proteins expressed in a cell at a given condition and time or tailored towards proteins located at the plasma membrane have been developed. Still, comparative analyses are only scarcely available. This thesis provides a systematic comparison of different plasma membrane isolation strategies for subsequent analysis by one-dimensional gel-free liquid chromatography mass spectrometry. Moreover, the sulfo-NHS-SS-biotinylation procedure, which overall performed best for the monitored criteria, was simplified by a competitive biotin elution strategy that proved to be fast, cost-effective and robust empowering the routine evaluation of plasma membrane proteomes on a larger scale. Intriguingly, computational analysis using different databases and prediction tools indicated a total of over 90 % of the proteins purified with the modified sulfo-NHS-SS-biotinylation protocol to be associated with the plasma membrane, mostly as interactors. In addition, the cell surface proteomic procedure developed within this thesis could be successfully employed to determine genetic and drug-induced alterations of the cellular plasma membrane composition.

At the same time, Triton X-114 phase separation coupled to filter-aided sample preparation was established as an equally reproducible and robust protocol for the complement of all membrane proteins.

In summary, the work presented herein not only enables a more routine evaluation of membrane and surface proteomes relevant to the functional correlation of transport, signaling and drug response properties. The combination of both technologies allows to dissect them, ultimately increasing the resolution available for these key sub proteomes.