Titelaufnahme

Titel
Imaging of endogenous mRNA splice variants in living plant cells / submitted ny Janett Göhring
VerfasserGöhring, Janett
Begutachter / BegutachterinLeodolter-Barta, Andrea
Erschienen2014
Umfang138 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)RNA Bildgebung / Molekulare Bojen / alternatives Spleißen / Nonsense-vermittelte mRNA Abbau / quantitative subzelluläre RNA Lokalisierung / Nukleinsäuremarkierung / wissenschaftliche Software / Telomere
Schlagwörter (EN)RNA imaging / Molecular Beacons / alternative splicing / Nonsense-mediated mRNA decay / quantitative subcellular RNA localization / nucleic acid probes / scientific software / telomeres
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-2965 Persistent Identifier (URN)
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Imaging of endogenous mRNA splice variants in living plant cells [19.58 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Alternative splicing (AS) is an important post-transcriptional process regulating gene expression in the majority of intron-containing genes in eukaryotes. However, AS does not merely increase the coding potential of an organism, but also has a substantial influence on the regulation of gene expression, even more so under stress conditions or during developmental phases. In order to gain an even higher regulatory complexity with the aim to reach even finer tuning of gene expression, AS is coupled to a cytoplasmic RNA degradation pathway termed Nonsense-mediated decay (NMD). During the first round of translation, this mechanism recognizes a number of signals intrinsic to transcripts and efficiently degrades them. One of these signals is the presence of a premature termination codon (PTC) with a certain distance to the next exon junction (>50 nucleotides) which has been shown to inevitably trigger NMD. However, recent studies found that some of the PTC-positive transcripts, which are expected to be degraded by NMD, do not accumulate in NMD-defficient mutants. The aim of this study was to investigate the fate of such transcripts in living cells. Up to this point it was unknown, how such transcripts escape the NMD machinery; however, one hypothesis was that they may not be exported to the cytoplasm.

In order to investigate the subcellular localization of particular RNA transcript variants as well as their single molecule dynamics, it was necessary to establish a quantitative imaging approach guaranteeing robust statistical analysis. Speciffic splice variants were targeted by hybridization-sensitive probes (Molecular Beacon, MB) and imaged via standard confocal laser scanning microscopy. The system was first tested on protoplasts of a gene inducible A. thaliana culture and later adapted to monitor the subcellular distribution of splice variants in wild type cells. With this system, it was eventually possible to demonstrate that the investigated PTC-positive, but NMD-insensitive transcripts are retained within the nucleus, and thus escaped the NMD machinery. Also, via bulk fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments, it became clear that fully-spliced transcripts move faster throughout the nucleoplasm than their alternatively spliced intron-retaining counterparts. Additionally, single-molecule tracing experiments of MB-labelled mRNA splice variants were performed, resulting in the detection of individual mRNAs in living cells.

In conclusion, these findings contribute to the understanding of the dynamic behavior of individual mRNA splice variants in living plant cells, and solved a multitude of technical challenges arising from the in vivo quantitative imaging approach.

The opportunity for an independent project arose during the last year of my PhD-study and involved the implementation of a software tool for the analysis of terminal restriction fragment (TRF) southern blot data.

Also, the software tool for telomere length analysis is an important asset to the respective scientific community and is, for that reason, implemented as open source and published as open access literature.

Zusammenfassung (Englisch)

Alternatives Spleißen (AS) zählt zu einen der wichtigsten posttranskriptionellen Prozesse zur Regulation der Genexpression intron-tragender Gene in Eukaryoten. Jedoch erweitert AS nicht nur das kodierende Potential von Organismen, sondern hat auch maßgeblichen Einfluss auf die Genexpressionsregulation unter Stressbedingungen oder während embryonaler Entwicklungsprozesse. Um eine höhere regulatorische Komplexität zu gewährleisten, ist AS außerdem an zytoplasmatische RNA Degradationswege gekoppelt, wie zum Beispiel der sogenannte Nonsense-vermittelte RNA Abbau (NMD). Während der Pionierrunde der Translation, erkennt dieser Prozess eine Reihe transkript-eigener Signale die dann zum Abbau führen. Frühzeitige Terminationscodons (PTCs), die mehr als 50 nt Distanz zur nächsten Exonbrücke besitzen, stellen eine dieser Signalgruppen dar. Allerdings zeigten eine Reihe von neueren Studien, dass PTC-beherbergende Transkripte sich nicht unbedingt immer in NMD-defekten Mutanten anhäufen. Das Ziel dieser Doktorarbeit ist es das Schicksal solcher Transkripte in lebenden Zellen zu untersuchen. Bisher war es unbekannt, wie diese Transkripte der NMD-Machinerie entgehen können. Eine Hypothese wäre es, dass sie nicht in das Zyotplasma exportiert werden. Um die subzelluläre Lokalisation bestimmter RNA Transkriptvarianten und deren Einzelmoleküldynamik zu untersuchen, war es notwendig ein dementsprechendes quantitatives Bildgebungsverfahren zu etablieren, welches außerdem eine robuste statistische Analyse der Daten zulässt. Hybridisierungssensitive Proben (namentlich Molekulare Bojen, MB) wurden zur Markierung bestimmter Spleißvarianten benutzt und nachfolgend mit Standard konfokaler laserscannender Mikroskopie abgebildet. Das System wurde zunächst an geninduzierbaren A.thaliana Protoplasten getested und nachfolgend so angepasst, dass es auch die Untersuchung der subzellulären Spleißvariantenverteilung in Wildtypen erlaubt. Es war schließlich möglich die nukleäre Aufstauung PTC-positiver, NMD-insensitiver Transkripte zu demonstrieren. Zur Anwendung kam auch die Methode der Fluoreszenzregeneration nach Belichtungsreiz (FRAP), die zeigten, dass vollständig gespleißte Transkripte sich mit einer höheren Geschwindigkeit durch das nukleäre Milieu bewegen als deren alternativ gespleißten intron-tragenden Gegenstücke. Desweiteren wurden Experimente zur Verfolgung einzelner RNA Moleküle in lebendenden Zellen durchgeführt. Schlussendlich tragen diese Ergebnisse zum weiteren Verständnis des dynamischen Verhaltens einzelner mRNA Spleißvarianten in lebenden Zellen bei. Diese Arbeit löst außerdem eine Vielzahl technischer Herausforderungen, die im Zusammenhang mit in vivo quantitativen Beldgebungsverfahren stehen. Desweiteren, ergab sich im letzten Jahr meines Doktoratsstudiums die Möglichkeit ein unabhängiges Projekt zu verfolgen, welches zum Ziel hatte ein funktionierendes Programm zur Analyse von terminalen Restriktionsfragmenten (TRF) zu entwickeln. Diese neue Software ermöglicht es Telomerlängen exakt von Southern Blots zu extrahieren und stellt damit eine wichtige Berreicherung für die entsprechende wissenschaftliche Gemeinschaft dar.

Aus diesem Grunde wurde das Program als öffentlich zugängliches (open source) Werkzeug zur Verfügung gestellt and als freizugängliches Manuskript veröffentlicht.