Titelaufnahme

Titel
Attempts to identify proteins possibly associated with delta subunits of gamma-aminobutyric acid-A (GABAA) receptors / submitted by Milos Vasiljevic
VerfasserVasiljevic, Milos
Begutachter / BegutachterinSieghart, Werner
Erschienen2012
Umfang108 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2012
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)GABAA Rezeptor / Delta Untereinheit / GABAA Rezeptor-assoziierte Proteine / extrasynaptische Rezeptoren / Massenspektrometrie / Calumenin / +-bindendes Protein / Gehirn-Entwicklung / migrierende Nervenzellen / adulte Neurogenese
Schlagwörter (EN)GABAA receptor / delta subunit / GABAA receptor-associated proteins / extrasynaptic receptors / mass spectrometry / calumenin / +-binding protein / brain development / migrating neurons / adult neurogenesis
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-666 Persistent Identifier (URN)
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Attempts to identify proteins possibly associated with delta subunits of gamma-aminobutyric acid-A (GABAA) receptors [3.87 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

GABAA Rezeptoren (GABAAR) sind Rezeptoren des wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitters im Gehirn der Säugetiere. Ein funktionaler GABAA Rezeptor ist ein Pentamer, das einen intrinsischen Cl- Kanal enthält, der mittels GABA-Bindung geöffnet wird und damit meistens eine Hemmung der elektrischen Aktivität der Zelle auslöst. Ein GABAAR wird aus 5 von insgesamt 19 Untereinheiten aufgebaut: Alpha 1-6, Beta 1-3, Gamma 1-3, Delta, Epsilon, Theta, Pi und Rho 1-3. GABAAR, die eine Delta Untereinheit enthalten, sind extrasynaptisch lokalisiert, werden schon bei geringen GABA Konzentrationen aktiviert und sind für die tonische Hemmung verantwortlich. Proteine, die mit GABAAR assoziiert sind, spielen eine wichtige Rolle in der Regulation der Rezeptoren auf verschiedenen subzellulären Ebenen. Allerdings sind bislang keine Proteine identifiziert worden, die mit der Delta Untereinheit direkt assoziiert sind. Das Ziel dieser Studie war, mittels Proteomics bis jetzt unbekannte Proteine zu identifizieren, die mit der Delta Untereinheit der GABAAR interagieren. Der intrazelluläre Bereich der Delta Untereinheit wird als wichtigste Interaktionsdomäne für die assoziierten Proteine angenommen. Aus diesem Grund wurden entweder der ganze intrazelluläre Bereich, oder seine Fragmente als "Köder" zum "Pull-Down" der assoziierten Proteine aus Nagetierhirnextrakten verwendet. Die Eluate von Pull-Down-Experimenten wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie (MS) analysiert. Dadurch konnte eine Liste von Proteinen erstellt werden, die möglicherweise mit der Delta Untereinheit assoziiert sind. Allerdings konnten die vermuteten Interaktionen einiger dieser Proteine mit der Delta Untereinheit in den folgenden Experimenten nicht eindeutig nachgewiesen werden. Diese Daten zeigen, dass MS Analysen mehrmals wiederholt werden müssen, um ihre Reproduzierbarkeit überprüfen und ihre Zuverlässigkeit erhöhen zu können. Darüber hinaus müssen die möglichen Interaktionen unter Verwendung verschiedener biochemischer, zellbiologischer und biophysischer Techniken weiter bestätigt werden. Im zweiten Teil dieser Studie wurde die räumliche und zeitliche Expression des Ca2+-bindenden Proteins Calumenin untersucht. Dieses Protein wurde zweimal in der MS als möglicher Interaktionspartner der Delta-Untereinheit identifiziert. Wir fanden, dass die Calumenin-mRNA eine relativ hohe und breite Expression in verschiedenen Bereichen des sich entwickelnden Maushirns aufwies, die sich jedoch im Zuge der Entwicklung der Tiere verringerte. Die höchste Expression des Calumenin-Proteins bei einem P0-Tier war im germinativen Neuroepithelium der ventrikularen Zonen nachweisbar. Bei einem adulten Tier war Calumenin nicht nur in verschiedensten differenzierten Gliazellen und Neuronen, sondern auch in unreifen Neuronen des Subkörnerzellbandes des Gyrus Dentatus präsent. Auf der subzellulären Ebene in vitro war Calumenin überwiegend im somatischen Bereich exprimiert, wo es mit dem ER und teilweise auch mit dem Golgi-Apparat kolokalisierte. Die subzelluläre Fraktionierung des Gehirns zeigte, dass Calumenin in Membranfraktionen angereichert wurde. Diese Ergebnisse weisen auf eine möglicherweise wichtige Rolle des Calumenin in der Neurogenese, Migration und Differenzierung der Neuronen, und/oder in Ca2+-Signaling zwischen Gliazellen und Neuronen hin.

Zusammenfassung (Englisch)

GABAA receptors (GABARs) are the major inhibitory neurotransmitter receptors in the mammalian brain. Each functional GABAAR is a pentamer that harbours an intrinsic Cl- channel which can be opened by GABA, mostly causing an inhibition of the cell. GABAARs are composed of 5 out of a total of 19 subunits: alpha 1-6, beta 1-3, gamma 1-3, delta, epsilon, theta, pi and rho 1-3. GABAARs containing the delta subunit are present at extrasynaptic sites, are activated by ambient concentrations of GABA and are responsible for generation of tonic inhibition. GABAAR- associated proteins play a key role in regulation of receptors at different subcellular levels. So far, no proteins have been described that are directly associated with the delta subunit. The goal of this study was to identify so far unknown proteins that interact with delta subunits of GABAAR, by using a proteomics approach. The intracellular loop of the delta subunit is believed to be the most important site of interaction with other proteins. Therefore, either the whole loop, or parts of it, were used as "baits" to pull down associated proteins from rodent brain extracts. The eluates from pull-down experiments were analysed by mass spectrometry (MS), resulting in a list of proteins potentially associated with the delta subunit. In subsequent experiments, however, possible interactions of some of these proteins with the delta subunit could not be unequivocally confirmed. These data indicate that MS analyses have to be reproducibly repeated several times to increase their reliability and that results need to be further confirmed using different techniques.

In the second part, the spatio-temporal expression analysis of the calcium-binding protein calumenin was investigated. This protein was identified twice by MS analysis as a potential interacting partner of the delta subunit. We found that calumenin mRNA exhibits a relatively high and broad expression in various regions of the developing mouse brain, but then declines over time. Levels of calumenin protein at P0 stage are highest in the germinative neuroepithelium of ventricular zones. In the adult mouse brain, it is present not only in various differentiated glial and neuronal cells, but also in immature neurons in the subgranular zone of the dentate gyrus. At the subcellular level in vitro, calumenin was distributed predominantly in the somatic region where it co-localized with the ER and partially with the Golgi apparatus. Subcellular fractionation of brain revealed that calumenin was enriched in membrane fractions. These data suggest a possible important role of calumenin in neurogenesis, neuronal migration and differentiation, and/or in Ca2+-signaling between glial cells and neurons.