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Title
Structural basis of eIF4G cleavage by picornaviral proteinases and the involvement of eIF4E / submitted by Martina Aumayr
AuthorAumayr, Martina
CensorSkern, Timothy
PublishedWien, 2016
DescriptionXXX, 218 Seiten : Illustrationen
Institutional NoteMedical University of Vienna, Univ., Dissertation, 2016
Annotation
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Bibliographic Source
NMR analysis of the interaction of picornaviral proteinases Lb and 2A with their substrate eukaryotic initiation factor 4GII, 2015, Protein Science 24, 1979-1996 / http://dx.doi.org/10.1002/pro.2807
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Virus-Wirt Interaktion / virale Proteasen / Protein-Protein Interaktion / Substratbindung / Kontrolle der Proteinsynthese
Keywords (EN)Virus-host interaction / viral proteases / protein-protein interactions / substrate binding / control of protein synthesis
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5366 Persistent Identifier (URN)
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Structural basis of eIF4G cleavage by picornaviral proteinases and the involvement of eIF4E [19.33 mb]
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Abstract (German)

Die Translation Initiation, der limitierende Schritt in der Proteinsynthese, ist in Eukaryoten stark reguliert. Zelluläre mRNA wird durch einen cap-abhängigen Mechanismus übertragen, welcher das Ribosom an die mRNA bringt. Picornaviren haben hochspezialisierte Interaktionen entwickelt, um die Proteinproduktion der Wirtszellen auszuschalten und dadurch ihre eigene Replikation zu begünstigen. Durch die Spaltung des eukaryotischen Translationinitiationsfaktor (eIF) 4G verliert die Zelle die Fähigkeit zelluläre mRNA zu translatieren, weil kein funktioneller Translationskomplex gebildet werden kann. Hingegen wird die Translation der viralen Proteine fortgesetzt, da diese durch die interne Struktur eingeleitet wird. Die Spaltung von eIF4G, die von eIF4E begünstig wird, wird in Picornaviren von zwei Proteasen ausgeführt, nämlich entweder der Lbpro (Gattung Aphthovirus) oder der 2Apro (Gattung Enterovirus). Diese Interaktion stellt einen wichtigen Virulenzfaktor dar und dessen Inhibierung wäre für die Entwicklung eines Medikamentes ein bedeutendes Ziel. Strukturelle Informationen über die Interaktion der Lbpro und 2Apro mit eIF4G gibt es wenig. Zu diesem Zweck führten wir Nukleare-Magnetische-Resonanz (NMR) Spektroskopie mit einem eIF4GII551-745 Fragment durch, welches die eIF4E-Bindungsstelle und die Bindungs- und Spaltstelle der Lbpro und 2Apro besitzt. Hierbei war es möglich 88% der Aminosäuren von eIF4GII551-745 zu bestimmen und jene Regionen im eIF4G herauszufinden, welche an der Bindung von eIF4E, der FMDV sLbpro oder der HRV2 2Apro beteiligt waren. eIF4GII551-745 blieb jedoch immer, auch nach der Zugabe von eIF4E, unstrukturiert.

Weiters konnten wir Unterschiede in der Spaltungs- und Bindungsaktivität der verschiedenen Proteasen beobachten. Obwohl eIF4E die Spaltung von eIF4G von allen picornaviralen Proteasen stimuliert, unterscheidet sich die jeweilige in vitro Stimulation. In Abwesenheit vom eIF4E wird kein stabiler Komplex zwischen eIF4GII551-745 und den picornaviralen Proteasen gebildet. Ist jedoch eIF4E vorhanden, wird ein stabiler heterotrimerischer Komplex mit allen picornaviralen Proteasen gebildet.

Interessanterweise bildet die HRV2 2Apro als einzige, auch in der Abwesenheit des eIF4GII551-745, einen stabilen Komplex mit eIF4E.

Allerdings, konnten wir mittels NMR und Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) zeigen, dass auch sLbpro beide Translationsfaktoren bindet. Die Stöchiometrie der monomerischen sLbpro und der CVB4 2Apro zeigt deutlich, dass ein heterotrimerischer Komplex zwischen diesen und eIF4GII551-745/eIF4E aus einem Molekül von jedem besteht (1:1:1). Im Gegensatz dazu verhält sich die HRV2 2Apro als Dimer, welcher gebrochen werden muss, damit ein 1:1 Komplex mit eIF4E gebildet werden kann, wofür eine Übernachtinkubation notwendig ist. Des Weiteren konnten die durch ITC gemessen Bindungsaffinitäten zwischen den Proteinen im heterotrimerischen Komplex bestimmt werden. Die Lbpro bindet den eIF4GII551-745/eIF4E Komplex mit einer höheren Affinität als die HRV2 2Apro oder CVB4 2Apro. Dieses Ergebnis steht auch im Einklang mit den sowohl in vivo als auch in vitro langsameren eIF4G Spaltungsraten.

Die Resultate zeigen, dass die picornaviralen Proteasen Lb und 2A den eIF4GII551-745/eIF4E Komplex unerwarteter Weise durch Kontakte mit beiden Translationsinitiationsfaktoren binden. Dabei wird ein stabiler, heterotrimerischer, dreieckiger Komplex gebildet. Die Interaktion mit beiden Translationsinitiationsfaktoren führt dazu, dass die Proteasen schneller an die notwendige Region im eIF4G positioniert werden. Dies bedeutet, dass die Proteasen aktiv in der Translation tätige eIF4G Moleküle anzielen, um sehr effizient die Proteinsynthese in der Wirtszelle abzuschalten. Letzteres wird allerdings von der Lbpro und der 2Apro unterschiedlich ausgeführt, woraus wir schließen, dass dieser Mechanismus auf unterschiedliche Art entwickelt wurde, obwohl die Viren stark miteinander verwandt sind.

Abstract (English)

Translation initiation, the rate-limiting step of protein synthesis, is highly regulated in eukaryotes. Cellular mRNA is translated via a cap-dependent mechanism that relies on the recruitment of the mRNA to the ribosome. Picornaviruses have evolved specialized interactions to efficiently shut off host cell protein synthesis.

Hijacking the host cell translation machinery is performed by cleaving the eukaryotic translation initiation factor (eIF) 4G. This prevents translation of capped cellular mRNA, as a functional translation initiation complex can no longer be built. However, viral translation continues, as it initiates internally. eIF4G cleavage is performed by either the Lbpro (genus aphthovirus) or the 2Apro (genus enterovirus); the presence of eF4E stimulates picornaviral eIF4G cleavage. The extent of the host cell shut-off determines viral virulence; thus, inhibition of this interaction is an attractive target for the development of anti-viral agents. Structural information on the interaction of Lbpro and 2Apro with mammalian eIF4G is sparse. To provide this, we used nuclear magnetic resonance (NMR) experiments to assign 88% of 15N amide signals of a fragment of eIF4GII551-745 comprising the eIF4E binding site as well as the binding and cleavage sites of Lbpro and HRV2 2Apro. We designated regions on eIF4G involved in binding eIF4E, FMDV sLbpro or HRV2 2Apro by performing NMR experiments with protein complexes. Furthermore, eIF4GII551-745 always remained intrinsically unstructured with no detectable conformational change upon the addition of eIF4E. Differences in the cleavage and binding activities of the examined proteases were noted. In vitro cleavage assays showed that eIF4E stimulates eIF4GII551-745 cleavage by all picornaviral proteases; however, the extent of the in vitro stimulation differed. No stable complex of eIF4GII551-745 with any of the proteases tested was observed in the absence of eIF4E; however, a stable heterotrimeric complex was formed with all proteases in the presence of eIF4E. Interestingly, HRV2 2Apro forms a stable binary complex with eIF4E even in the absence of eIF4GII551-745. In addition, sLbpro binds both eIF4GII551-745 and eIF4E as determined by NMR and isothermal titration calorimetry (ITC). NMR and ITC showed that the C-terminal residues Cys133, Gln185, Glu186 and Leu188 on sLbpro interact with eIF4E. Heterotrimeric complexes formed by the eIF4GII551-745/eIF4E complex with the monomeric sLbpro and CVB4 2Apro showed a stoichiometry of 1:1:1. In contrast, the HRV2 2Apro, which is a dimer, has to be disassembled in order to form a binary 1:1 complex with eIF4E. This binary complex has a kinetic component as an overnight incubation was necessary. However, a stable binary complex of eIF4E was formed after 10 minutes with the 2Apro C138S mutant. Cys138, predicted to form a disulphide bond between two monomers, may hinder eIF4E from entering into the HRV2 2Apro binding site. The binding affinities of eIF4GII551-745/eIF4E with the picornaviral proteases, measured via ITC, confirmed that a tight heterotrimeric complex was formed with Lbpro, whereas HRV2 and CVB4 2Apro form a heterotrimeric complex with lower affinity for the eIF4GII551-745/eIF4E complex. This is in line with the slower in vivo and in vitro rates of eIF4G cleavage. In summary, the picornaviral proteases Lb and 2A stably bind the eIF4GII551-745/eIF4E complex, unexpectedly contact both translation initiation factors and form distinct heterotrimeric triangular complexes. The interaction with both translation initiation factors positions the proteinases to the required region of eIF4G, thus targeting actively translating eIF4G molecules to efficiently shut-off host cell protein synthesis. The mechanisms of host-cell shut-off performed by Lbpro and 2Apro differ; therefore, closely related viruses have evolved distinct mechanisms to achieve similar outcomes.