Titelaufnahme

Titel
Investigation of HDL endocytosis in endothelial cells and the influence of mTOR inhibition on the interplay of HDL and endothelial cells / submitted by Stefanie Fruhwürth
VerfasserFruhwürth, Stefanie
Begutachter / BegutachterinStangl, Herbert
Erschienen2014
Umfang65 Bl : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)mTOR / SR-BI / Endothelzellen / HDL / Zellmigration /
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-6872 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Investigation of HDL endocytosis in endothelial cells and the influence of mTOR inhibition on the interplay of HDL and endothelial cells [19.61 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

High density lipoprotein (HDL) besitzt anti-atherogene Eigenschaften, die vermutlich für die umgekehrt proportionale Korrelation der HDL-Cholesterin Spiegel im Blut und dem Auftreten von kardiovaskulären Erkrankungen ausschlaggebend sind. Die wahrscheinlich am besten beschriebene dieser Eigenschaften ist die Beteiligung der HDL Partikel am Reversen Cholesterin Transport (RCT), bei welchem HDL überschüssiges Cholesterin von peripheren Zellen zur Leber transportiert, dem Ort an dem Cholesterin vom Körper ausgeschieden werden kann. Damit HDL Cholesterin, das sich in Schaumzellen in der Arterienwand angesammelt hat, aufnehmen und abtransportieren kann, müssen die HDL Partikel notwendigerweise das vaskuläre Endothel durchqueren. Die genauen Mechanismen dieser sogenannten HDL Transzytose sind nicht bekannt. In der vorliegenden Studie wollten wir zum einen den Aufnahmeprozess der HDL Partikel genau untersuchen und zum anderen den Einfluss des mammalian target of rapamycin (mTOR)-Inhibitors Rapamycin auf den HDL-Rezeptor scavenger receptor, class B, type I (SR-BI) und auf die Funktion der Endothelzellen charakterisieren. Wir haben die Aufnahme der HDL Partikel sowie den Transfer von Lipiden von HDL-Partikeln in primären Endothelzellen (human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)) mittels Licht- und Elektronenmikoskopischer Techniken untersucht. Mit Hilfe neuer, fluoreszierender Cholesterin-Surrogate haben wir den Transfer von Cholesterin und Cholesterin Estern aus HDL Partikeln analysiert. Wir konnten in HUVECs zeigen, dass HDL verschiedene Stadien des Endozytose-Prozesses, nämlich clathrin-coated pits, tubuläre Endosomen und multivesikulären Endosomen, passiert.

Zusätzlich haben wir die Aufnahme von HDL in vivo verfolgt, indem wir fluoreszenz-markiertes HDL in Mäuse injiziert haben. In der Leber war HDL vor allem in Endothelzellen lokalisiert, was die Bedeutung der HDL- Aufnahme im Endothel unterstreicht. Als Nächstes haben wir die Auswirkungen des mTOR-Inhibitors Rapamycin, der als immunsupprimierendes Medikament eingesetzt wird, auf Endothelzell-Migration, Stickstoffmonoxid (NO) Produktion sowie die Expression und Funktion des HDL-Rezeptors SR-BI untersucht. Die Kinase mTOR ist zentraler Bestandteil eines komplexen Netzwerkes, das den zellulären Stoffwechsel kontrolliert. mTOR-Inhibitoren haben viele positive Effekte aber auch unerwünschte systemische Nebenwirkungen, einschließlich Hyperlipidämie.

Wir konnten zeigen, dass die SR-BI Expression in HUVECs durch Rapamycin herunterreguliert wird, was aber keinen Einfluss auf die HDL-Aufnahme hatte. Rapamycin hat weiters die durch HDL stimulierte Phosphorylierung von Akt und endothelial nitric oxide synthase (eNOS) beeinträchtigt und in der Folge die NO Produktion vermindert. Gleichermaßen war HDL stimulierte Endothelzell-Migration beeinträchtigt. Da SR-BI neben seiner Funktion bei der HDL-Aufnahme auch in die Aktivierung zellulärer Signaltransduktion durch HDL involviert ist, haben wir die Beteiligung von SR-BI an eben genannten Merkmalen endothelialer Dysfunktion, ausgelöst durch Rapamycin, analysiert. SR-BI Inaktivierung alleine hatte keinen Einfluss auf Zell-Migration oder eNOS Aktivierung, allerdings konnte SR-BI Überexprimierung der durch Rapamycin induzierten endothelialen Dysfunktion teilweise entgegenwirken. In dieser Arbeit haben wir die Aufnahme von HDL und den Lipidaustausch in humanen Endothelzellen in vitro und in vivo charakterisiert. Weiters haben wir die Auswirkungen des mTOR-Inhibitors Rapamycin auf SR-BI Expression und die durch HDL stimulierte NO Produktion und Zell-Migration in humanen Endothelzellen analysiert. Unsere Ergebnisse tragen zum Verständnis der HDL Endozytose in Endothelzellen bei und beschreiben die Effekte von Rapamycin auf endotheliale Dysfunktion, ein frühes Merkmal der Atherosklerose.

Zusammenfassung (Englisch)

High density lipoproteins (HDL) possess several anti-atherogenic properties which are likely responsible for the inverse correlation of HDL-cholesterol levels with the incidence of cardiovascular disease. The probably best described function of HDL particles is their contribution to reverse cholesterol transport (RCT) by facilitating the transport of excess cholesterol from peripheral tissues to the liver, the site of cholesterol excretion in the body. HDL transcytosis through the vascular endothelium has been proposed to be crucial for the removal of accumulating cholesterol from macrophage foam cells, residing in the subendothelial space of arteries, but the exact mechanisms are not fully understood. In this study we sought to identify on one hand the way stations of HDL uptake in endothelial cells and on the other hand the influence of the mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor rapamycin on the regulation of the HDL receptor scavenger receptor, class B, type I (SR-BI) and on endothelial cell functions. We analyzed HDL particle uptake and HDL-derived lipid uptake in primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with light and electron microscopical methods. Using novel fluorescent cholesterol surrogates we followed the uptake of cholesterol and cholesterol esters from HDL particles. Moreover, we found HDL to be endocytosed via clathrin-coated pits, tubular endosomes and multivesicular bodies in HUVECs. In addition, we followed the fate of HDL in vivo, by injecting fluorescently labeled HDL into mice. In the liver, HDL was primarily found in endothelial cells, emphasizing the importance of the endothelium in HDL uptake. Next, we investigated the consequences of mTOR inhibition using rapamycin, which is an approved immunosuppressant drug, on endothelial cell migration, nitric oxide (NO) production and the expression and function of the HDL receptor SR-BI. Inhibition of the kinase mTOR, which is a pivotal regulator of cellular metabolism, has despite many beneficial outcomes severe systemic side effects as well, including hyperlipidemia. We found that rapamycin down-regulates SR-BI expression in HUVECs, but surprisingly did not impair HDL uptake. In addition, mTOR inhibition led to a decrease in HDL stimulated Akt and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) phosphorylation, resulting in impaired nitric oxide (NO) production. Similarly, HDL induced endothelial cell migration was affected. Since SR-BI is not only responsible for HDL uptake but also HDL induced cellular signaling, the contribution of SR-BI to these features of endothelial dysfunction seen upon rapamycin treatment was assessed by SR-BI knockdown and overexpression. SR-BI knockdown alone could not mimic the rapamycin dependent effects on cell migration or eNOS activation, whereas SR-BI overexpression could partly counteract endothelial dysfunction. In summary, we have investigated HDL uptake and its lipid exchange in human endothelial cells in vitro and in murine liver in vivo. In addition, we have analyzed the effects of mTOR inhibition using rapamycin on SR-BI expression, HDL stimulated NO production, and cell migration in human endothelial cells. Our observations contribute to the understanding of HDL endocytosis in endothelial cells and the mechanisms by which rapamycin influences lipid metabolism and endothelial dysfunction, an early hallmark of atherosclerosis.