Titelaufnahme

Titel
Tracking the A2A [A tief 2A] receptor and analyzing the role of diffusion for receptor function / submitted by Patrick Thurner
Verfasser / VerfasserinThurner, Patrick Andreas
Begutachter / BegutachterinZezula, Jürgen
Erschienen2014
Umfang70 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Adenosin A2A Rezeptor / Diffusion / Single particle tracking / Rezeptor Funktion
Schlagwörter (EN)Adenosine A2A receptor / collision coupling / diffusion / single particle tracking / signaling
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-6001 Persistent Identifier (URN)
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Tracking the A2A [A tief 2A] receptor and analyzing the role of diffusion for receptor function [26.71 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der A2A-Adenosine Rezeptor ist ein klassischer G-Protein gekoppelter Rezeptor und unterscheidet sich von den drei anderen Adenosin Rezeptor-Subtypen durch den langen Carboxyl-Terminus ohne Palmitoylierungsstelle und einer speziellen G Protein Kopplung. Nicht das klassische Model der Kollisionskopplung sondern das "restricted collision coupling" charakterisiert das Signalverhaltens des A2A Rezeptor am Besten. Der aktivierte Rezeptor kann dabei nur mit einer geringen Anzahl von G-Proteinen interagieren, setzt also entweder eine Eingeschränkung der Mobilität des Rezeptors und/oder der Lokalisation der Interaktion vorraus. Beide Phänomene resultieren in einem geänderten Diffusionsverhalten des A2A Rezeptors. Meine Hypothese war deshalb, dass die strukturellen Besonderheiten des A2A Rezeptors dessen Diffusionverhalten verändern und so sein Signalverhalten beeinflussen.

Um dies zu untersuchen habe ich die Techniken des "Single particle tracking" (mit Quantum Dots) und des "Hidden Makrov Models" kombiniert.

Zuerst wurde der kausale Zusammenhang zwischen "restrcited collsion coupling" und dem Fehlen der typischen Palmitoylierungsstelle am A2A Rezeptor C-terminus untersucht. Eine A2A Rezeptor-Mutante, die ein Cystein an Position 309 enthält, zeigte nun ein Signalverhalten passend zur Kollisionskopplung. Die Analyse der Diffusionseigenschaften dieser Mutante zeigte verringertes "confinement" und erhöhte laterale Mobilität. Dies verdeutlichte, dass die Palmitoylierung des Rezeptors die lokale Einschränkung der Mobilität (confinement) aufhob und konsekutiv zur Kollisionskopplung führte. Als Nächstes wurde die Rolle des hydrophoben Kerns und der Interaktion des C-Terminus mit zytosolischen Proteinen für Agonisten-induzierte Verringerung der lateralen Mobilität in hippocampalen Neuronen untersucht. Obwohl eine trunkierten A2A Rezeptor Mutante (1-311), welche den hydrophoben Kern repräsentiert, mit reduzierte Mobilität auf Zugabe des Agonisten reagierte, konnten nicht alle Veränderungen die beim Wildtyp beobachtet wurden, damit erklärt werden. Deshalb wurde ein zytosolischer Interaktionpartner gesucht. Das MAGUK Protein SAP102 wurde in einem "yeast two-hybrid screen" als möglicher Partner identifiziert. Im Gegensatz zum Wildtyp zeigte die A2A Rezeptor Mutante mit modifizierter SAP102 Bindungsstelle (383-RVRAA-387 statt 383-DVELL-387) Administration von Agonisten keine Änderung des Diffusionsverhaltens. Dies verdeutlichte den regulatorischen Einfluss von SAP102 auf A2A Rezeptor "confinement" in Neuronen. Die vorliegenden Daten zeigen, dass die fehlende Palmitoylierung des C-Terminus, die Agonisten induzierten Veränderungen des hydrophoben Kerns und die Protein-Protein-Interaktionen mit dem C-Terminus am beobachteten Phänotyp des A2A Rezeptors beteiligt sind.

Zusammenfassung (Englisch)

The adenosine A2A receptor is a classical G-Protein coupled receptor and displays distinctive features compared to the other three adenosine receptor subtypes. Among those are structural properties such as a very long carboxyl terminus that lacks the canonical palmitoylation site. In addition, the A2A receptor differs in the mode of G-protein activation. The standard "collision coupling"-model of receptor-G protein is insufficient to describe the behavior of the A2A receptor.

The alternative "restricted collision coupling"- model provides a more adequate description. It predicts that the number of possible interactions of the active receptor is limited or "restricted". This in turn requires changes in mobility of the interacting proteins and/or localization of the interaction. Both should result in alterations of the diffusive properties of the A2A receptor. Thus, I hypothesized that structural features affect the receptor function by impacting its diffusion, and utilized the technique of single particle tracking and Hidden Markov models to test this hypothesis. First a causal relationship between restricted collision coupling and lack of the canonical palmitoylation site on the A2A receptor C-terminus was explored. Therefore an A2A receptor mutant containing a cysteine at position 309, which is conserved among the other Adenosine receptor family members, was generated. It displayed signaling properties compatible with collision coupling. Diffusional analysis of the mutant A2A R309C receptor revealed reduced confinement and increased lateral mobility upon agonist treatment, demonstrating that palmitoylation of the A2A receptor relieves confinement and consecutively restricted collision coupling. Next, the contribution of the hydrophobic core and the C-terminus tethering for agonist induced reduction of lateral mobility was analyzed in hippocampal neurons. Agonist induced reduction in lateral mobility of a truncated A2A receptor (1-311), as a representative of the hydrophobic core, was insufficient to account for all observed changes in diffusion. Hence, we searched for a tethering partner and a yeast two-hybrid screens identified the MAGUK protein SAP102 as a candidate. Diffusion of the A2A receptor mutant (383-RVRAA-387) deficient of the identified SAP102 binding site (383-DVELL-387) remained unaltered under agonist treatment. Similarly, overexpression of SAP102 blunted the response observed in wild type receptor but had no effect on the RVRAA-mutant. This revealed the regulatory influence of SAP102 on A2A receptor confinement in neurons.

The findings in this thesis provide evidence that lack of palmitoylation, agonist induced changes in the hydrophobic core and protein-protein interaction with the C-terminus all contribute to the observed A2A receptor phenotype.