Titelaufnahme

Titel
Identification and molecular characterization of inhibitors of necroptosis / submitted by Astrid Fauster, MSc
Weitere Titel
Identifizierung und molekulare Charakterisierung von Nekroptose-Inhibitoren
Verfasser / VerfasserinFauster, Astrid
Begutachter / BegutachterinSuperti-Furga, Giulio
ErschienenWien, 2016
Umfang138 Seiten : Diagramme
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)programmierter Zelltod / Nekroptose / Ponatinib / Pazopanib / RIPK3 / RIPK1 / MLKL / HSP90 / Protein-Interaktion
Schlagwörter (EN)programmed cell death / necroptosis / Ponatinib / Pazopanib / RIPK1 / RIPK3 / interaction proteomics / MLKL / HSP90
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-7765 Persistent Identifier (URN)
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Identification and molecular characterization of inhibitors of necroptosis [3.29 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Zelltod ist von entscheidender Bedeutung für die Homöostase multizellulärer Organismen. Die Beseitigung obsolet gewordener, geschädigter oder infizierter Zellen kann durch genetisch kodierte Zelltodprogramme bewerkstelligt werden. Es gibt mehrere regulierte Zelltod-Signalwege, und deren Störung kann zur Entstehung von Krankheitspathologie und Gewebeschäden führen. Nekroptose ist eine entzündungsfördernde, programmierte Form nekrotischen Zelltods und trägt zur Pathophysiologie verschiedener menschlicher Erkrankungen, unter anderem Herzinfarkt, Schlaganfall und Arteriosklerose, bei. Nekroptotischer Zelltod kann durch Ligandenbindung an Toll-like- oder Todesrezeptoren, bakterielle und virale Infektionen, sowie im Rahmen steriler Entzündungen ausgelöst werden. Die Signaltransduktion erfolgt über die Proteine RIPK3 und MLKL, wobei die Kinase RIPK3 durch eines der vorgeschalteten Adapterproteine RIPK1, TRIF oder DAI aktiviert wird. Während Nekroptose im Rahmen der angeborenen Immunantwort gegen intrazelluläre Erreger einen vorteilhaften Effekt hat, verstärkt sie die schädlichen Auswirkungen steriler Entzündungen. Die Eingrenzung pathologischer Nekrose durch pharmakologische Nekroptose-Inhibition stellt somit eine vielversprechende Behandlungsstrategie dar, jedoch sind gegenwärtig keine Nekroptose-Inhibitoren für den klinischen Gebrauch verfügbar. Ich setzte mir daher zum Ziel, pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren, welche den nekroptotischen Zelltod blockieren. Im Zuge meiner Doktorarbeit habe ich eine repräsentative Auswahl zugelassener, und damit bezüglich Pharmakokinetik und Sicherheit erprobter, Arzneimittel auf Nekroptose-Inhibition getestet. Ich zeige, dass die beiden in der Krebstherapie eingesetzten Kinase-Inhibitoren Ponatinib und Pazopanib den nekroptotischen Zelltod spezifisch und mit hoher Wirksamkeit blockieren. Um den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus aufzuklären, identifizierte ich die zellulären Angriffspunkte von Ponatinib mittels chemischer Proteomik und liefere damit die erste umfassende Aufstellung der molekularen Wirkorte dieses Medikaments. Bemerkenswerterweise finden sich die wichtigsten Proteine des Nekroptose-Signaltransduktionswegs unter den Wirkstoffzielen. Mittels verschiedenere biochemischer Tests bestätige ich, dass Ponatinib sowohl RIPK1 als auch RIPK3 bindet und hemmt, während Pazopanib bevorzugt RIPK1 zum Angriffspunkt hat. Ponatinib ist somit der erste beschriebene duale RIPK1/RIPK3 Inhibitor. Da die detaillierte Beschreibung des Nekroptose-assoziierten Protein-Netzwerks die Identifizierung zusätzlicher Angriffspunkte für die gezielte Modulation und therapeutische Intervention erwarten lässt, setzte ich mir des Weiteren zum Ziel, die Voraussetzungen für die Massenspektrometrie-basierte Kartierung des Nekroptose-Signaltransduktionswegs zu schaffen. Zu diesem Zweck wurde ein induzierbares, retrovirales Expressionssystem, welches sich für Protein-Interaktionsstudien auf Basis von Affinitätsreinigung im Zweischritt-Verfahren eignet und im jeweils physiologisch relevanten zellulären Zusammenhang angewendet werden kann, etabliert. Das System eignet sich weiter für die Analyse von Proteinen deren Expression zytotoxische Effekte hervorruft, wie ich anhand einer konstitutiv aktiven Form von MLKL demonstriere. Im Rahmen dieser Experimente entdeckte und charakterisierte ich die Bedeutung des molekularen Chaperon HSP90 für die Stabilität und Funktionalität von MLKL. Zusammengenommen identifiziere ich in der vorliegenden Arbeit neue Nekroptose-Inhibitoren unter bereits zugelassenen sowie derzeit in klinischer Testung befindlichen Medikamenten und beschreibe den jeweils zugrundeliegenden molekularen Wirkmechanismus. Diese Ergebnisse schaffen somit eine konsolidierte chemische Basis für die Entwicklung klinisch relevanter Inhibitoren des nekroptotischen Zelltods.

Zusammenfassung (Englisch)

The balance between cell proliferation and cell death is crucial for the homeostasis of multicellular organisms. Cells that have become obsolete, damaged or infected can be eliminated by genetically encoded death programs. Multiple regulated cell death pathways exist, and disease pathologies and tissue damage ensue when these processes are disturbed. Necroptosis is a pro-inflammatory form of programmed necrotic cell death that has been shown to be involved in the pathophysiology of several human diseases, including myocardial infarction, stroke, and atherosclerosis. Necroptotic cell death depends on receptor interacting serine/threonine kinase (RIPK)3 and its substrate mixed-lineage kinase domain-like (MLKL). RIPK3 activation is mediated by the upstream adaptor proteins RIPK1, TIR domain-containing adapter inducing interferon-beta (TRIF) or DNA-dependent activator of interferon regulator factors (DAI) upon death receptor or Toll-like receptor (TLR) stimulation, bacterial or viral infection, and in the context of sterile inflammation. Necroptotic cell death has a beneficial role in innate immune responses against intracellular pathogens. In contrast, it exacerbates sterile-injury induced inflammation. Limiting pathological necrosis by interfering with programmed necrotic cell death thus represents a promising therapeutic strategy. However, no necroptosis inhibitors are currently available for clinical use. For this reason, I aimed at identifying pharmacological agents that block necroptotic cell death. In the course of this thesis, I performed a phenotypic screen for necroptosis inhibitors on a representative panel of drugs with Food and Drug Administration (FDA)-approval, implying established pharmacokinetic and safety profiles. I identified the kinase inhibitors ponatinib and pazopanib, both used as anti-cancer therapeutics, to potently and specifically block necroptotic cell death. In order to unravel the precise molecular mode of action effectuating necroptosis inhibition, I chose to apply an unbiased chemical proteomics-based target deconvolution approach to ponatinib. This study provides the first comprehensive description of the cellular target spectrum of this clinically used drug, notably revealing key members of the necroptosis signaling pathway. By a series of complementary, biochemical assays, I showed that pazopanib preferentially targets RIPK1, whereas ponatinib directly binds and blocks both RIPK1 and RIPK3. This work thus establishes ponatinib as the first dual RIPK1/RIPK3 inhibitor. As detailed understanding of the protein network underlying necroptosis signaling is expected to reveal novel entry points for targeted modulation and therapeutic intervention, I furthermore aimed at providing the basis for mass spectrometry (MS)-based mapping of the necroptosis pathway. To this end, an inducible, retroviral expression system enabling tandem affinity purification (TAP)-based interaction studies in the respective physiologically relevant cellular setting was established and characterized. I demonstrated the feasibility of studying cell death-inducing proteins using this vector system by a constitutively active mutant form of MLKL, leading to the identification of MLKL as a novel heat shock protein 90 (HSP90) client protein. Collectively, the work I present here has identified necroptosis inhibitors among compounds currently undergoing clinical development and already approved drugs, as well as unraveled their molecular mode of action. These findings thus provide a consolidated basis for medicinal chemistry approaches aimed at the development of anti-necroptosis agents for future clinical application in necroptosis-associated human diseases.