Titelaufnahme

Titel
Proteomic study of hydrophobic (membrane) proteins and complexes / author Sung Ung Kang
VerfasserSung Ung, Kang
Begutachter / BegutachterinLubec, Gert ; Sieghart, Werner
Erschienen2010
Umfang186 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2010
Anmerkung
Abstract in German, abstract in English
Quelle der Aufnahme
Gel-based mass spectrometric analysis of a strongly hydrophobic GABAA-receptor subunit containing four transmembrane domains. Nat Protoc. 2009;4(7):1093-102.
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)massenspektrometrische / BN-PAGE / Multi-dimensional gel electrophoresis / GABAA Rezeptor / Bioinformatik / Membranproteine / gel-basierte Proteomik
Schlagwörter (EN)Mass Sepctrometry / BN-PAGE / Multi-dimensional gel electrophoresis / GABAA receptor / Bioinformatics / Membrane protein / Gel-based proteomics
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-7022 Persistent Identifier (URN)
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Proteomic study of hydrophobic (membrane) proteins and complexes [8.51 mb]
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Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Membranproteine sind hydrophobe Proteine, zu denen auch Rezeptoren, Ionenkanäle und Transporter gehören. Sie sind für die zelluläre Funktion von grundlegender Bedeutung. Ihre Identifikation, ihre tatsächliche Aminosäure-Sequenz und ihre posttranslationale Modifizierung ist für das Verständnis ihrer Struktur und Funktion unerlässlich.

Die Analyse der Membranproteine und ihrer Proteinkomplexe kann in zwei Methoden unterteilt werden: gel-unabhängige und gel-basierte Proteomik.

Gel-unabhängige Proteomik hat den Vorteil, dass die Membranproteine und -komplexe direkt experimentell untersucht werden können. Die Entwicklung der gel-basierten Proteomik geht trotz ihrer diversen Vorteile (wie Trennung der Proteine durch verschiedene Gelsysteme, Identifizierung mittels Westernblot, Modifizierung z.B. durch chemische Acetylierung) langsam voran, weil sich Proteinaggregation auch während der Elektrophorese ereignen kann, und damit ein traditionelles Problem darstellt.

Detergentien und Coomassie-Brillant-Blue spielen eine wichtige Rolle bei der Überwindung dieses Problem. Sie isolieren, solubilisieren und manipulieren die Membranproteine für ihre nachfolgende biochemische und physikalische Charakterisierung. Mit einer Kombination aus Detergentien, unterschiedlichen gel-basierten Trennungsmethoden, und verschiedenen massenspektrometrischen Techniken wie matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF/TOF), triple quadrupole time of flight mass spectrometry (qQ-TOF/MS) und high capacity ion-trap (HCT), gelang es, die Expression der Membranproteine zu untersuchen.

Das Ziel der hier beschriebenen Studie war die Etablierung von Separationsmethoden und die Charakterisierung von Membranproteinen unter Verwendung von zwei modifizierten Gel-Elektrophoresesystemen, (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride (BAC)/SDS-PAGE, sowie Blue-Native(BN)-PAGE gekoppelt mit SDSn [SDS hoch n]-PAGE) um Membrankomponenten in Zukunft besser identifizieren und charakterisieren zu koennen.

Um die anschließende massenspektrometrische Technik zu etablieren, wurden zuerst zwei detallierte Protokolle wie die "In-Gel-Digestion― und die Identifikation der löslichen Proteine und Membranproteine mit Transmembrandomänen (TMDs) verwendet.

Anschließend wurden rekombinante [gamma]-Aminobuttersäure-A (GABAA [GABA tief A])-Rezeptoruntereinheiten und -komplexe als Proteinmodel mit 4 TMDs untersucht, um ihre 100%ige Analyse und Charakterisation zu erreichen. Und schließlich stellt diese Studie auch unterschiedliche Bioinformatik-Instrumente (Mascot, Mascot Deamon und ModiroTM PTM explorer) und eine chemische Modifikationen der Proteine für höhere Sequenzerfassung und Charakterisation der TMDs vor.

Zusammenfassung (Englisch)

Understanding of structure and function of hydrophobic proteins, e.g. receptors, channels, transporters and so called ‗membrane proteins', is suggested for pharmacological intervention because it is elementary for cellular function.

Analysis of membrane proteins and complexes in proteomics can be divided into two categories, gel-free and gel-based proteomics. Gel-free proteomics has significantly advanced as their characterization can be approached experimentally, whereas development of gel-based proteomics has been slow despite of its diverse advantages (e.g. protein separation by the different types of PAGE, protein identification by western blotting and mass spectrometry, and detection of chemically induced acetylation) due to protein aggregation during electrophoresis.

Detergents and Coomassie brilliant blue (CBB) have played important roles in this effort. They serve as tools to isolate, solubilize and manipulate membrane proteins for subsequent biochemical and physical characterization. Combination of detergents and various gel-based separation methods coupled with mass spectrometric technology, e.g.

matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF/TOF), triple quadrupole time of flight mass spectrometry (qQ-TOF/MS) and high capacity ion-trap (HCT) is possible to examine the expression of membrane proteins.

This study aimed to establish separation methods for characterization of membrane proteins by using two modified gel-electrophoresis procedures, (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride (BAC)/SDS-PAGE and blue native (BN)-PAGE followed by SDSn [SDS hoch n]-PAGE), to make the components of membranes become increasingly amenable to identification and characterization.

First, two detailed protocols for establishing mass spectrometric techniques, in-gel digestion and identification of (1) soluble proteins and (2) membrane proteins containing transmembrane domains (TMDs), were introduced. Subsequently, using recombinant gamma-aminobutyric acid A (GABAA) receptor subunits and complexes as a model proteins which contain 4 TMDs, procedures were established that allowed complete sequencing of GABAA proteins. In addition, this study introduced several bio-informatic tools (Mascot, Mascot Deamon and ModiroTM PTM explorer) and chemical modifications for complete sequence coverage and characterization of TMDs. At the end, a solid method for unambiguous identification and characterisation of GABAAR subunits and novel phosphorylation sites of beta-subunits is proposed. The analytical work can be extended to other GABAAR [GABA tief A]subunits or even other brain receptors or other integral membrane proteins, thus opening the way to analyse receptors in health and disease.