Titelaufnahme

Titel
Expression analysis and molecular characterization of the c20orf116 gene product / submitted by Dashurie Neziri
Verfasser / VerfasserinNeziri, Dashurie
Begutachter / BegutachterinWagner, Ludwig
Erschienen2012
Umfang97 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)menschliche genom / c20orf116 / signalpeptid / PCI domäne / proteasom / transkription / translation
Schlagwörter (EN)human genome / c20orf116 / signal peptide / PCI domain / proteasome / transcription / translation
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-2415 Persistent Identifier (URN)
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Expression analysis and molecular characterization of the c20orf116 gene product [8.51 mb]
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Zusammenfassung (Englisch)

After definition of the human genome, it has become an important task to perform research on up till now undefined open reading frames.

The goal represents the clarification of the primary structure and function of the novel proteins. By comparative expression analysis of normal versus tumour tissue, we could observe over expression of C20orf116 in multiple tumour tissues. Encouraged by these findings we decided to clone and characterize the non-defined transcript and translation product. Multiple tissue Northern blot analysis showed expression of the 1.35 kb transcript coding for 314 amino acids in liver, placenta and heart with less quantity in kidney and lung as well as in various regions of the central nervous system. After production of the recombinant protein in E. coli and insect cells, polyclonal and monoclonal antibodies against the C20orf116 gene product were generated.

This enabled us to demonstrate the protein expression in liver, kidney, pancreas, thyroid and brain. Sequence alignment identified a PCI-domain at the C-terminus of the C20orf116 gene product. The PCI-domain is characterized as a strong protein-protein interaction domain and is contained in several subunits of three well known large multisubunit protein complexes: the proteasome, the COP9 signalosome (CSN) and the translation initiation factor (eIF3). Differential centrifugation revealed presence of the protein within the nucleus but mainly at the peroxisomes/mitochondria, high density microsomes, plasma membrane and at less quantity in cytoplasm.

The finding to influence promoter driven luciferase activity suggests potential involvement of this protein in translation or transcription processes. Direct DNA binding could be ruled out by initial protein-DNA interaction assays.

The results obtained in this study allow us to hypothesize that the C20orf116 gene product might represent an up till now unidentified member of the CSN signalosome or takes part in the eIF3 complex.

Zusammenfassung (Deutsch)

Die Decodierung des menschlichen Genoms konfrontiert die Wissenschaft mit vielen unbekannten kodierten Regionen und deren Translationsprodukten, den Proteinen. Einer der wesentlichen Aufgaben ist es nun diese Transkripte und Translationsprodukte in ihre Primärstruktur und deren Funktion genau zu charakterisieren. In vorhergehende Arbeit ist uns die Überexpression des offenen Leserahmen 116 des Chromosom 20 aufgefallen. Dies motivierte zu dieser Studie im Rahmen derer das Transkript kloniert werden konnte. Das C20orf116 kodiert für 314 Aminosäuren. Im Northernblot wurde die Expression des etwa 1.35 kb grossen Transkriptes in der Leber, Niere, Plazenta, und dem Zentralnervensystem festgestellt. Rekombinant konnte das Protein sowohl in E. coli als auch in Insekten Zellen erzeugt werde. Die Produktion von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern ermöglichte die Expressionsanalyse in Geweben und Zelllinien, wo das Protein in der Leber aber auch in der Niere dargestellt werden konnte. Anhand von in silico Analysen wurde am N-terminus ein Signalpeptid und am C-terminus eine bereits für mehrere Proteine bekannte PCI-Domäne festgestellt. Die PCI-Domäne ist eine bekannte Protein-Protein Interaktioneinheit und wird in Subkomponenten des Proteasoms, des COP9 Signalosome und des Translationsinitiation-factors gefunden. Die subzelluläre Lokalisation wurde anhand einer differentialen Zentrifugation teils im Zellkern aber hauptsächlich in Peroxisomen/Mitochondrien aber auch in den Mikrosomen hoher Dichte und in geringem Ausmaß im Cytosol angesetzt. Immunfluoreszenzoptische Untersuchungen zeigten das Protein vor allem im Zytoplasma aber auch im Zellkern. Funktionelle Untersuchungen zeigen einen Einfluss auf Promoter gesteuerte Luziferase-Expressionsanalysen.

Eine direkte DNA Bindung konnte in Initialen DNA Bindungsstudien nicht nachgewiesen werden. In Zusammensicht könnte eine funktionelle Beteiligung in Transkription oder Translation vermutet werden.