Titelaufnahme

Titel
Role of Pl3 Kinase in the differentiation and activation of human basophils and mast cells / submitted by Katharina Blatt
VerfasserBlatt, Katharina
Begutachter / BegutachterinValent, Peter
Erschienen2011
Umfang98 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Mastzellen / Basophile / kinase / IgE-Rezeptor / Mastozytose
Schlagwörter (EN)mast cells / basophils / kinase / IgE-receptor / mastocytosis
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5102 Persistent Identifier (URN)
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Role of Pl3 Kinase in the differentiation and activation of human basophils and mast cells [2.72 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Phosphoinositol 3 Kinase spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung und im Wachstum von Mastzellen und basophilen Granulozyten.

Aus diesem Grund untersuchten wir die Effekte des neuen Phosphoinositol 3 Kinase/mTOR blockers NVP-BEZ235 auf die IgE-abhängige Aktivierung und das Wachstum von Basophilen und Mastzellen. Die Zell-Proliferation wurde mittels Thymidineinbau bestimmt. Die Beurteilung und Quantifizierung der NVP-BEZ235- induzierten Apoptose erfolgte lichtmikroskopisch und durchflußzytometrisch über Caspase 3- und AnnexinV/PI Färbungen, sowie mit Hilfe eines TUNEL Assay. Überdies wurde die Wirkung von NVP-BEZ235 auf die IgE-abhängige Histamin-Freisetzung und die IgE-abhängige Hochregulation der Oberflächenantigene CD63 und CD203c untersucht. In einem weiteren Schritt analysierten wir die Effekte von NVP-BEZ235 auf die Aktivierung von bestimmten Signalmolekülen mittels Durchflußzytometrie und Western Blotting. Letztlich wurden auch die in vivo Effekte von NVP-BEZ235 in einem Mausmodell untersucht. Es zeigte sich, dass NVP-BEZ235 den IgE-abhängigen Histamin-Release in Basophilen hemmt, und zwar sowohl in Normalspendern als auch in Allergikern, mit IC50 Werten von 0.5 bis 1 M. Weiters konnte durch NVP-BEZ235 die anti-IgE-induzierte Hochregulation von CD203c in humanen Basophilen und die Hochregulation von CD63 in den Mastzellen gehemmt werden. Ebenso hemmt NVP-BEZ235 die IgE-abhängige Mediator-Freisetzung in den Mastzellen. Zusätzlich wurde durch NVP-BEZ235 das IL-3-abhängige Wachstum der Basophilen und die SCF-abhängige Entwicklung der Mastzellen aus ihren Vorläuferzellen unterdrückt. Überdies blockierte NVP-BEZ235 das Wachstum der leukämischen Basophilen-Zelllinien KU812 und der Mastzell-Leukämie-Zellinie HMC-1. Obwohl wachstums-inhibierende Effekte von NVP-BEZ235 mit ähnlichen IC50 Werten in beiden HMC-1 Subklonen gezeigt werden konnten, scheint die Wirkung von NVP-BEZ235 in der HMC-1.1, welche keine KIT D816V Mutation exprimiert, stärker zu sein.

NVP-BEZ235 blockierte auch die Aktivierung der Signalmoleküle Akt, S6 und STAT5 in den HMC-1 Zellen, während der mTOR Blocker RAD001 nur die Aktivierung von S6 inhibierte. Letztlich konnte gezeigt werden, dass das in vivo Wachstum der HMC-1 Zellen in einem Xenotransplantantations-Modell in NMR1-Foxn1nu Mäusen durch NVP-BEZ235 nachhaltig gehemmt wird. Der mTOR Inhibitor RAD001 zeigte auch hier keine vergleichsame Wirksamkeit. Zusammen-fassend kann gesagt werden, dass NVP-BEZ235 ein potenter Inhibitor des Wachstums und der Aktivierung von basophilen Granulozyten und Mastzellen ist. Ob sich daraus klinisch-therapeutische Konzepte ableiten lassen, werden zukünftige Studien zeigen.

Zusammenfassung (Englisch)

The phosphoinositide 3 kinase (PI3 kinase) and the mammalian target of rapamycin (mTOR) have been implicated as critical signaling molecules in the activation and growth of mast cells (MC) and basophils (BA). We examined the effects of the PI3 kinase/mTOR-targeting drug NVP-BEZ235 on immunoglobulin E (IgE)-dependent activation and growth of BA and cultured cord blood-derived MC. Growth of MC and BA were calculated by measuring 3H-thymidine uptake, and apoptosis by morphologic analyses, Caspase 3 staining, AnnexinV/propidium (PI) staining and TUNEL assay. Cell activation was determined in histamine release experiments and by measuring upregulation of CD63 and CD203c after challenging with IgE plus anti-IgE or allergen. The effects of NVP-BEZ235 on expression of activated signal transduction molecules were analyzed by flow cytometry and Western blotting. NVP-BEZ235 was found to inhibit IgE-dependent histamine release in BA in healthy individuals as well as in allergic patients (IC50 0.5-1 M). NVP-BEZ235 was also found to counteract anti-IgE-induced upregulation of CD203c in BA, and to block IgE-dependent upregulation of CD63 as well as IgE-dependent mediator-secretion in MC. Additionally, NVP-BEZ235 was found to suppress interleukin-3 (IL-3)-dependent differentiation of BA and stem cell factor (SCF)-dependent development of MC from their progenitors.

Finally, NVP-BEZ235 inhibited growth in the BA leukemia cell line KU812 and in the MC leukemia cell line HMC-1. Although growth-inhibitory effects of NVP-BEZ235 showed similar IC50 values (0.01 M) in both HMC-1 subclones, strong apoptosis-inducing effects were only seen in HMC-1.1 cells lacking KIT D816V, but not in HMC-1.2 cells expressing KIT D816V.

Apoptosis-inducing effects of NVP-BEZ235 were not mimicked by the mTOR-blocker RAD001. NVP-BEZ235 was found to inhibit the activation of the downstream signaling molecules Akt, S6, and STAT5 in HMC-1 cells. By contrast, as expected, RAD001 was only capable of suppressing the activation of S6. Finally, we examined the in vivo effects of NVP-BEZ235 in a xenotransplantation model employing HMC-1 cells and NMR1-Foxn1nu mice. In these experiments, NVP-BEZ235 was found to exert strong growth-inhibitory effects on the in vivo growth of neoplastic MC, whereas RAD001 showed no substantial effect in this model. In summary, NVP-BEZ235 inhibits IgE-dependent activation in BA and MC, and produces growth-inhibitory effects in neoplastic BA and MC. Whether these drug effects have clinical implications remains to be determined.