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Title
Neuroprotective Role of Creatine in Mouse Models for Arginine: Glycine Amidinotransferase Deficiency and Guanidinoacetate-N-Methyltransferase Deficiency / submitted by Furhan Iqbal
AuthorIqbal, Furhan
CensorBodamer, Olaf
Published2009
Description154 Bl. : graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2009
Annotation
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Neuroprotection / Kreatin / AGAT / GAMT
Keywords (EN)Neuroprotection / Creatine / AGAT / GAMT
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-4108 Persistent Identifier (URN)
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Neuroprotective Role of Creatine in Mouse Models for Arginine: Glycine Amidinotransferase Deficiency and Guanidinoacetate-N-Methyltransferase Deficiency [3.03 mb]
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Abstract (German)

Einleitung Die Häufigkeit der schweren, hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie beträgt etwa 2-4 Fälle je 1000 reifer Neugeborener, wobei die Häufigkeit bei unreifen, frühgeborenen Kinder bis zu 60% erreichen kann. Zwischen 20 und 50% der betroffenen Kinder sterben innerhalb der ersten 4 Lebenswochen, bis zu 25% der überlebenden Kinder weisen neurologische Langzeitkomplikationen auf.

Der Entwicklung und Evaluation neuroprotektiver Substanzen an verschiedenen Tiermodellen kommt vor dem Hintergrund des oben gesagten eine wesentliche Bedeutung zu. In der vorgelegten Arbeit soll deshalb die Rolle von Kreatinmonohydrat als neuroprotektive Substanz in zwei verschiedenen Mausmodellen untersucht werden. Im Einzelnen wurde der Effekt von Kreatinmonohydrat auf den kurz- und langzeitigen neurologischen Outcome, sowie auf strukturelle Veränderungen des Gehirns in keratin defizienten Mausmodellen (AGAT und GAMT knock out Mausmodellen) untersucht. Methodik Es wurden je Mausmodell 120 Mäuse (Wildtyp und knock-out) untersucht.

Jede Gruppe wurde in mehrere Untergruppen unterteilt, wovon die Nahrung einer Subgruppe mit 2% Kreatin supplementiertm der andere Teil kreatinfrei ernährt wurde. In jeder Subgruppe wurden Wildtyp Tiere mit knock-out Tieren verglichen. Nach einem standardisierten hypoxisch-ischämischen Eingriff durch Ligatur der rechten Arterie Carotis Communis und Verabreichung von 8% Sauerstoff über 20 Minuten der neonatalen Maus, wurden nach 7 Tagen entweder die neonatalen Reflexe (Righting, Cliff Aversion, Negative Geotaxia) getestet oder nach 10-18 Tagen verschiedene neurologische Tests (MWM, OF and Rotarod) durchgeführt. Zusätzlich wurden an Gehirnschnitten die Größe der Infarktzonen bestimmt. Die Analyse der Metabolite des Kreatinstoffwechsel, der Aminosäuren und des Homocystein wurde bei allen Mäusen durchgeführt. Ergebnisse Die knock-out Mäuse zeigten deutlich schlechtere Ergebnisse bei sämtlichen neurologischen Testverfahren im Vergleich zu ihren Wildtyp Geschwistern. Zusätzlich zeigten sie sich anfälliger nach Hypoxie-Ischämie und hatten deutlich größere Infarktareale und einen schlechteren neurologischen Outcome. Knock-out Mäuse nach Kreatinmonohydratsupplementation hingegen zeigten deutlich geringere Infarktareale und einen wesentlich besseren neurologischen Outcome als ohne Kreatinsupplementation.

Plasma und Harn Kreatin waren nach Kreatin Supplementation deutlich erhöht, wohingegen Guanidinoazetatkonzentrationen bei GAMT knockout Mäusen reduziert waren. AGAT knock-out Mäuse hatten ohne Kreatinmonohydratsupplementation eine deutlich erhöhte Mortalität (30%) und zeigten eine deutliche Gewichtsreduktion.

Diskussion und Schlussfolgerungen In der vorgelegten Arbeit konnte die neuroprotektive Rolle des Kreatinmonohydrates nach einem hypoxisch-ischämischen Events eindeutig belegt werden. Es zeigten sich nach Kreatinsupplementation nicht nur ein deutlich verbessertes Outcome, sondern auch deutlich kleinere (Post-) Infarktareale im Vergleich zu nicht mit Kreatin behandelten Tieren. Der Effekt war unabhängig von Art des Mausmodelles. Der neuroprotektive Effelt von Kreatinmonohydrat sollte nun in Kombination mit anderen potentiell neuroprotektiven Substanzen bzw.

Hypothermie unter anderem auch an Neugeborenen untersucht warden.

Abstract (English)

Introduction. The incidence of severe hypoxia ischemia encephalopathy is 2-4:1000 full term births, approaching 60% in low birth weight premature newborns. Between 20-50% of asphyxiated newborns die within the newborn period, and up to 25% of the survivors will exhibit permanent neuropsychological handicaps, including mental retardation, cerebral palsy, epilepsy, or learning disabilities. Because of greater clinical significance, several animal models have been developed to elucidate pathological mechanisms and to investigate the neuroprotective role of pharmacological substances. Presently the role of creatine as a neuroprotective substance is intensively under investigation both in vitro and in vivo including animal experiments following HI with varying protocols differing in dosage and duration of creatine supplementation. In general Cr supplementation was either used as preconditioning agent or applied following HIE.

In this study we have used two different knockout mouse models both lacking endogenous creatine synthesis to demonstrate the neuroprotective effect of Cr following HIE. As these knockout mice present with CDS, we have conducted a similar series of experiments in parallel, without HI, in order to demonstrate the therapeutic effect of Cr supplementation following AGAT and GAMT deficiency.

Materials and Methods. During short term experiments various neonatal (Righting, Cliff Aversion and Negative geotaxis) reflexes were studied to demonstrate the effect of CDS and/or HIE. Brain infarcts of wild type and knockout pups were measured following HI.

During long term experiments, mice were fed on either 2% Cr supplemented or Cr free diet for 10 weeks followed by a battery of neurological tests including MWM, OF and Rota rod. Plasma and 24 h urine was collected at the end of the experiment to analyze the concentration of various amino acids and metabolites of Cr synthesis pathway. H & E, TTC and GFAP staining was done on brain slices in order to compare the differences in histology between various diet, genotypes and treatments.

Results. It was observed during short term experiments that knockout pups can be differentiated from wild type on the basis of Cliff aversion and negative geotaxis reflex performance for both mouse models under study. Knockout pups were also more susceptible to HIE having increased mortality during experimental procedure and revealed bigger infarcts upon TTC staining of brain slices. During long term experiments, knockout mouse supplemented with 2% Cr, for both models, performed significantly better than their littermates knockout mouse on Cr free diet during water maze (learning and memory) and rotating rod (neuro-muscular coordination and balance) test. We also confirmed that levels of Cr in plasma and urine increases several hundred folds while levels of GAA decrease following dietary Cr supplementation. Hypoxic ischemic insult had a more negative effect on AGAT knockout mice compared to GAMT. With increasing mortality (30%) also a significant reduction in weight gain, starting from 3rd week of experiment, was observed for AGAT knockout mice on Cr free diet. Discussion. This is for the first time that the HI model has been applied to Cr deficient mouse models which describe the potential neuroprotective role of Cr. The improved neurological output and decreased brain infarcts following dietary Cr supplementation makes it a candidate to be used for the treatment of HIE in human neonates. Conclusion. In conclusion, we found creatine a sort of 'wonder drug' as Cr supplementation has improved the clinical picture not only in CDS but also under hypoxic ischemic conditions in both AGAT and GAMT deficient mouse. Cr therapy is already in practice for AGAT and GAMT deficiency but it is recommended to investigate it further for the optimal treatment of HIE.