Titelaufnahme

Titel
The effect of hypoxia on the treatment of melanoma / submitted by Daniela Pucciarelli
Verfasser / VerfasserinPucciarelli, Daniela
Begutachter / BegutachterinBreiteneder, Heimo
Erschienen2015
UmfangXVII, 107 Bl.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2015
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Melanom / BRAF / Vemurafenib / Hypoxie / CSPG4
Schlagwörter (EN)Melanoma / BRAF / Vemurafenib / Hypoxia / CSPG4
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5528 Persistent Identifier (URN)
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The effect of hypoxia on the treatment of melanoma [2.36 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das maligne Melanom ist die häufigste Ursache von Hautkrebs-assoziierten Todesfällen. Das Melanom ist häufig mit einer Mutation im BRAF Gen an der Aminosäureposition 600 assoziiert, was zu einer unkontrollierten Aktivierung des MAP-Kinase Signalwegs und zu einer Zunahme der Zellproliferation und Migration führt. Obwohl BRAF Inhibitoren wie Vemurafenib das Wachstum von BRAFV600 mutierte Melanomen hemmen können, kommt es häufig zum Auftreten von Resistenz-assoziierten, sekundären Mutationen, welche alternative Signalwege aktivieren. Die Entwicklung einer Antikörper-basierten, zielgerichteten Therapie wäre daher sehr hilfreich. Eines der spezifischen Melanom-assoziierten Antigene ist das Chondroitin Sulfat Proteoglycan 4 (CSPG4).

Ein Ziel dieser Dissertation war es zu untersuchen, ob CSPG4-spezifische Antikörper den antiproliferativen Effekt von Vemurafenib verstärken sowie deren Einfluss auf die Expression von Proteine, welche für das Zellwachstum und das Überleben wichtig sind, zu analysieren. Zwei BRAFV600E mutierte Melanomzelllinien, von denen eine CSPG4 (CSPG4+) exprimierte, wurden mit Vemurafenib und CSPG4-spezifischen Antikörpern behandelt. Die antiproliferativen Eigenschaften sowie die Fähigkeit zur Invasion und Migration wurden untersucht. Die Expression von Proteinen der MAPK, JAK-STAT und PI3K Signalwege wurde analysiert. Wir konnten zeigen, dass die Kombination von Vemurafenib mit CSPG4-spezifischen Antikörpern den antiproliferativen Effekt von Vemurafenib verstärkte und in BRAF(V600E)/CSPG4+ Melanomzellen im Vergleich zu BRAF(V600E)/CSPG4- Melanomzellen die Migration hemmte. Allerdings beobachteten wir keinen Einfluss auf das invasive Potential von Melanomzellen die mit Vemurafenib und CSPG4-spezifischen Antikörpern behandelten wurden.

Jedoch verminderte diese Kombination die Proteinexpression von pAKT.

Obgleich die Kombination von therapeutischen Maßnahmen dazu geeignet ist, verschiedene Tumorarten, wie auch das Melanom erfolgreicher zu bekämpfen, können Veränderungen im Tumormikromilieu zu einer Progression der Erkrankung führen. Melanome entwickeln hypoxische Areale, welche wesentlichen Einfluss auf den Metabolismus der Tumorzellen haben. Es komme dabei zu einer Erhöhung der Heterogenität des Tumors, und in der Folge zur Entwicklung von therapieresistenten Zellpopulationen. Ein weiteres Ziel dieser Dissertation war es, den Einfluss von Hypoxie auf die Wirkung von Vemurafenib und seinen Effekt auf das proliferative, invasive und migratorische Potential von Melanomzellen und auf die Proteinexpression von Markerproteinen der Hypoxie zu untersuchen. In der Folge wurde der Effekt von Vemurafenib und CSPG4-spezifischen Antikörpern auf den Zellmetabolismus und auf die Expression von Proteinen der MAPK, JAK-STAT und PI3K Signalwege in hypoxischen Melanomzellen untersucht. Der anti-proliferative und anti-migratorische Effekt von Vemurafenib wurde an drei hypoxischen Melanomzelllinien untersucht. Weiters wurde die Expression von hypoxia-inducible factor 1 [alpha] (HIF1[alpha]) und der carbonic anhydrase IX (CAIX) sowie Veränderungen im Zellmetabolismus analysiert. Wir konnten zeigen, dass das Ansprechen auf Vemurafenib unter hypoxischen Bedingungen in einer der drei getesteten Melanomzellinien vermindert war, wobei es zu einer Zunahme der Proliferation und Migration kam. Das spiegelte sich in einer unveränderten Proteinexpression von HIF1[alpha] und CAIX wieder. In weitere Folge stellten wir fest, dass Melanomzellen, welche mit Vemurafenib und CSPG4-spezifizische Antikörpern unter hypoxischen Bedingungen behandelt wurden, ihr migratorisches Potential bewahrten, es jedoch zu einer Zunahme ihres invasiven Potentials kam.

CSPG4 und mutiertes BRAF gleichzeitig zielgerichtet therapeutisch zu erfassen, erhöht die Effizienz und es kann dabei gelingen, sekundäre Mutationen zu verhindern. Das Tumormikromilieu hat jedoch einen erheblichen Einfluss auf das Ansprechen auf die Therapie.

Zusammenfassung (Englisch)

Malignant melanoma is the most frequent cause of skin cancer-related death. Despite the progress in understanding the biology of this disease, it still remains a significant clinical problem.

Melanoma is often associated with activating mutations in the BRAF gene at the amino acid position 600, which results in an uncontrolled activation of the MAP-kinase pathway and as a consequence leads to an increment in cell proliferation and migration. Although several BRAF inhibitors, such as vemurafenib, have been proven to be highly effective in inhibiting BRAFV600 mutated melanomas, resistant-associated, secondary mutations, which reactivate alternative survival pathways, often occur. To improve current options for targeted therapies, the development of antibody-based, targeted therapies could have a significantly impact. One of the specific melanoma antigens is the chondroitin sulfate proteoglycan 4 (CSPG4). One aim of this thesis was to evaluate the ability of CSPG4-specific, anti-225D9+-TT antibodies to enhance the anti-proliferative effects of vemurafenib in vitro and to identify multiple signaling pathway proteins important for cell growth and survival that are modified by this combination. Two mutated BRAFV600E melanoma cell lines, one of them expressing CSPG4 (CSPG4+), were treated with vemurafenib and anti-225D9+-TT antibodies and their anti-proliferative, migrative and invasive capacities were evaluated. The expression of MAPK, JAK-STAT and PI3K signaling pathway proteins was analyzed. We demonstrated that the combination of vemurafenib with anti-225D9+-TT Abs enhanced the anti-proliferative effects of vemurafenib and the ability to block the migration capacity in BRAF(V600E)/CSPG4+ melanoma cells compared to BRAF(V600E)/CSPG4- melanoma cells. No significant changes were observed in the invasive capacity of vemurafenib and anti-225D9+-TT Abs treated melanoma cells. The combinational treatment decreased the protein expression of pAKT.

Although combined therapeutic approaches are the future weapons for fighting many types of tumors, including melanoma, adaptations in the tumor microenvironment can lead to tumor progression. One important feature of melanoma is the development of hypoxic areas which have a strong impact on the metabolism of tumor cells. Under this condition, melanoma increases the heterogeneity of the tumor mass, which results in the development of a drug resistant cell subpopulation. Another aim of this thesis was to investigate the role of hypoxia in the response to vemurafenib and its effect on the anti-proliferative, migratory and invasive potentials of melanoma cells and on the expression of hypoxic markers. Moreover, we investigated the effect of vemurafenib and anti-225D9+-TT antibodies on the metabolism and on MAPK, JAK-STAT and PI3K signaling pathways of hypoxic melanoma cells.

Anti-proliferative and migrative potentials of vemurafenib were measured in three mutated BRAFV600E melanoma cell lines exposed to hypoxia.

Furthermore, expression of hypoxic factors, such as hypoxia-inducible factor 1 [alpha] (HIF1[alpha]) and carbonic anhydrase IX (CAIX), and metabolic changes in the extracellular pH were evaluated. We demonstrated that the response to vemurafenib was abolished under hypoxic conditions in one of the three melanoma cell lines tested, increasing also its proliferative and migrative capacities. This was reflected in unchanged protein expression levels of HIF1[alpha] and CAIX. Moreover, we observed that melanoma cells treated with vemurafenib and CSPG4-specific, anti-225D9+-TT Abs in hypoxic conditions retained the magnitude of their migration potential but increased the magnitude of their invasive capacities.

Targeting CSPG4 in combination with a BRAF inhibitor, such as vemurafenib, enhances the therapeutic efficacy and overcomes secondary drug resistance in melanoma cells. However, the tumor microenvironment has a profound influence on this response.