Titelaufnahme

Titel
Introduction of a palmitoylation site into the C-terminus of the A2A-adenosine receptor relieves restricted collision coupling / submitted by Simon Keuer
Verfasser / VerfasserinKeuerleber, Simon
Begutachter / BegutachterinFreissmuth, Michael
Erschienen2013
UmfangIX, 108 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2013
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
Quelle der Aufnahme
Auch erschienen in: Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(50):42104-18 / URL: http://www.jbc.org/content/287/50/42104
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)G-Protein-gekoppelter Rezeptor / A2A-Adenosinrezeptor / Palmitoylierung / Diffusion / Restricted Collision Coupling / Lipid Raft
Schlagwörter (EN)G protein-coupled receptor / A2A-adenosine receptor / palmitoylation / diffusion / restricted collision coupling / lipid raft
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-3352 Persistent Identifier (URN)
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Introduction of a palmitoylation site into the C-terminus of the A2A-adenosine receptor relieves restricted collision coupling [3.35 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der A2A-Adenosinrezeptor, ein Rhodopsin-ähnlicher G-Protein-gekoppelter Rezeptor, ist einer von vier Subtypen der Adenosinrezeptor-Familie. Im Vergleich zu den anderen drei Rezeptor-Subtypen weist er drei Besonderheiten auf: (i) er interagiert mit seinem zugehörigen G-Protein Gs in einer Weise, die sich mit dem kinetischen Modell "restricted collision coupling" beschreiben lässt, (ii) er hat einen langen flexiblen C-Terminus, welcher eine Andockstelle für zahlreiche Proteine darstellt und (iii) ihm fehlt die kanonische Palmitoylierungsstelle am Ende der Helix 8 in seinem intrazellulären C-Terminus. In der vorliegenden Arbeit prüfte ich die Hypothese, dass "restricted collision coupling" und das Fehlen einer Palmitoylierung in Zusammenhang stehen. Die A2A-Rezeptor-R309C-Mutante, erstellt aufgrund der Tatsache, dass die anderen Adenosinrezeptor-Subtypen an der entsprechenden Stelle ein palmitoyliertes Cystein tragen, wird palmitoyliert. Das wurde sowohl durch metabolische Markierung als auch durch Massenspektrometrie bestätigt. Nach Aktivierung durch Agonist erstellte Dosis-Wirkungskurven für cAMP Akkumulierung und Phosphorylierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen zeigten mit zunehmenden Expressionslevels der A2A-Rezeptor-Mutante eine Verschiebung nach links. Diese Kurven unterschieden sich damit grundlegend von den entsprechenden Kurven des Rezeptor-Wildtyps und ließen sich stattdessen mit dem "collision coupling" Model erklären. Aufnahmen einzelner sich bewegender Rezeptoren, die mit Quantum Dots markiert wurden ("Single Particle Tracking"), zeigten, dass sich Rezeptor-Wildtyp und -Mutante in ihrer Mobilität unterschieden; die Diffusion des Wildtyps verlangsamte sich nach Aktivierung durch Agonist, während das Diffusionsverhalten der Mutante unverändert blieb. Des Weiteren fand sich im Vergleich ein höherer Anteil des Wildtyps in jenen Membranfraktionen, die gegen Extraktion mit Detergens resistent waren. Darüber hinaus wurde nach Rezeptor-Aktivierung beim Wildtyp die cAMP Akkumulierung stärker durch Cholesterol-Depletion beeinträchtigt als bei der Mutante.

Zusammengefasst zeigen die vorliegenden Daten, dass das Einbringen eines palmitoylierten Cysteins in den C-Terminus des A2A-Rezeptors (i) das "restricted collision coupling" aufhob, (ii) die Diffusion der Agonist-gebundenen Rezeptor-Mutante beschleunigte und (iii) zur Umverteilung der A2A-Rezeptor-Mutante an der Zelloberfläche führte.

Zusammenfassung (Englisch)

The A2A-adenosine receptor, a rhodopsin-like G protein-coupled receptor, is one of the four subtypes of the adenosine receptor family.

It stands out from its peers, because (i) it engages its cognate G protein Gs by restricted collision coupling, (ii) it has a long flexible C-terminal tail that provides a docking site for several proteins and (iii) it lacks the canonical palmitoylation site located in helix 8 within the intracellular C-terminus of the receptor. I explored the hypothesis that restricted collision coupling and the lack of palmitoylation are causally related. To this end, an A2A receptor-R309C mutant was generated, based on the fact that the other adenosine receptors carry a palmitoylated cysteine at the corresponding position.

Indeed, palmitoylation of the mutant occurred as demonstrated by employing metabolic labeling as well as mass spectrometry experiments.

Concentration-response curves for cAMP accumulation and for phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases following agonist stimulation showed a leftward shift with increasing A2A receptor-R309C expression levels. This is in contrast to corresponding curves of wild type A2A receptor and in agreement with collision coupling. Employing single particle tracking of A2A receptors labeled with quantum dots furthermore showed a difference in the lateral mobilities of the wild type A2A receptor and the mutant A2A receptor-R309C. Agonist treatment slowed the diffusion of the wild type A2A receptor, whereas the diffusion of the mutant A2A receptor-R309C remained unaltered. Furthermore, the wild type A2A receptor was found to be associated to a higher extent with detergent resistant membrane fractions. In addition, cAMP accumulation induced by the wild type A2A receptor was more susceptible to inhibition by cholesterol removal.

Taken together, the data presented in this work show that engineering a palmitoylated cysteine into the C-terminus (i) relieved restricted collision coupling, (ii) resulted in accelerated diffusion of the agonist-liganded A2A receptor-R309C and (iii) led to the redistribution of the mutant A2A receptor-R309C at the cell surface.