Titelaufnahme

Titel
Identification of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) [GABA tief A] receptor homopentamers as crystallization candidates : expression screening and pre-crystallization analysis / submitted by Stephan Radner
Verfasser / VerfasserinRadner, Stephan
Begutachter / BegutachterinSieghart, Werner
Erschienen2013
Umfang93 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2013
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
Quelle der Aufnahme
Radner, S., Celie, P.H.N., Fuchs, K., Sieghart, W., Sixma, T.K., Stornaiuolo, M., 2012. Transient transfection coupled to baculovirus infection for rapid protein expression screening in insect cells. J. Struct. Biol. 179, 4655.
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)GABAA Rezeptor / Cys-loop Rezeptor / Proteinexpression / Proteinreinigung / Insektenzellen / Baculovirus / Expressionsscreening / Präkristallisationsanalyse
Schlagwörter (EN)GABAA receptor / Cys-loop receptor / Protein expression / Protein purification / Insect cells / Baculovirus / Expression screening / Pre-crystallization analysis
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-2917 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Identification of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) [GABA tief A] receptor homopentamers as crystallization candidates [7.51 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Strukturaufklärung von Proteinen erfordert große Mengen an reinem, monodispersem und stabilem Protein. Besonders für Membranproteine sind diese Bedingungen oft schwer zu erfüllen. Jüngste Durchbrüche in der Strukturaufklärung eukaryotischer Membranproteine mittels Röntgenkristallographie wurden durch die Kombination einer Reihe technologischer und methodologischer Entwicklungen hinsichtlich Proteinexpression, -reinigung und Präkristallisationsanalyse ermöglicht.

Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein Transfektion/Infektion-basiertes Expressionssystem für das Screening von Expressionskonstrukten in Insektenzellen geeignet ist. Die Transfektion/Infektions-Methode ist eine funktionale Alternative zu anderen, herkömmlichen Screeningmethoden, welche rekombinantes Baculovirus verwenden. Sie basiert auf Gentransfer mittels Transfektion, gefolgt von der Induktion der Proteinexpression durch Infektion mit nicht-rekombinantem Baculovirus. Vektoren, welche Expression mittels einer Kombination der Baculoviruspromotoren ie1 und p10 und dem Enhancerelement hr5 regeln, sind für diese Methode geeignet. Die Infektion mit nicht-rekombinantem Baculovirus führt zu einer drastischen Verstärkung der basalen Aktivität dieser Elemente und in Folge zu Proteinüberexpression. Mehrere Vektoren können zugleich ko-transfiziert/infiziert werden: Transfektion/Infektion ermöglicht dadurch das Screening mehrerer ko-exprimierter Proteine sowie Proteinkomplexe. Zusammengefasst belegen die Ergebnisse, dass das Transfektion/Infektions-Protokoll ein funktionaler und innovativer Ansatz für Proteinexpressionsscreening für Struktur- und Funktionsstudien ist. Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit wurden aus beta3-Untereinheiten bestehende GABAA Rezeptor-Homopentamere in für Kristallisationsversuche geeigneter Qualität und Quantität hergestellt.

Hierfür wurden Protein-Engineering, Baculovirus-basierte Proteinexpression, Präkristallisationsanalyse mittels Fluoreszenzdetektion-Größenausschlusschromatographie und ein zweistufiges Reinigungsprotokol basierend auf Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie kombiniert. Es konnte gezeigt werden, dass mittels Detergens extrahierte GABAA Rezeptor beta3-Untereinheit-Homopentamere bis zu hoher Homogenität gereinigt werden können und als monodisperse Spezies vorliegen. Somit hat die hier beschriebene Arbeit die ersten, maßgeblichen Hindernisse, nämlich Proteinexpression und Reinigung von intakten solubilisierten Komplexen, auf dem Weg zur langersehnten Strukturaufklärung eines GABAA Rezeptors bewältigt.

Zusammenfassung (Englisch)

Structure determination of proteins requires large amounts of pure, monodisperse, and stable protein. For membrane proteins, these requisites are often difficult to meet. Recent breakthroughs in structure determination of eukaryotic membrane proteins by X-ray crystallography were enabled by the combination of a variety of technological and methodological developments for heterologous protein expression, purification, and pre-crystallization analysis. In the first part of this thesis, it could be demonstrated that a transfection/infection based expression system is suitable for screening of expression constructs in insect cells. The transfection/infection method represents a valid alternative to other traditional screening methodologies using recombinant baculovirus. It is based on gene delivery by transfection coupled to the induction of protein expression by infection with non-recombinant baculovirus. Vectors that control expression by a combination of the baculovirus promoters ie1 and p10 and the enhancer element hr5 are among the ones suitable for this method.

Infection with non-recombinant baculovirus drastically increases the basal activity of these elements, leading to protein overexpression.

Multiple vectors can be simultaneously co-transfected/infected, making transfection/infection amenable for screening of multiple co-expressed proteins and protein complexes. Taken together, these results prove that the transfection/infection protocol is a valid and innovative approach for protein expression screening for structural and functional studies.

In the second part of the present thesis, GABAA receptor homopentamers formed by the beta3-subunit were produced in quality and quantity suitable for crystallization trials. For this purpose, protein-engineering, baculovirus-based protein expression in insect cells, pre-crystallization analysis using fluorescence-detection size exclusion chromatography, and a two-step purification protocol based on affinity and size exclusion chromatography were combined. It could be demonstrated that detergent-extracted GABAA receptor beta3-subunit homopentamers can be purified to high homogeneity and are present as a monodisperse species. Thus, the work of this thesis has successfully overcome the first major obstacles, i.e. protein expression and purification of intact solubilized complexes, on the road towards the long-awaited structure determination of a GABAA receptor.