Titelaufnahme

Titel
Investigating the role of different ribonucleoprotein particles in dendritic mRNA localization and translational control / by Manuel Zeitelhofer
Verfasser / VerfasserinZeitelhofer, Manuel
Begutachter / BegutachterinDahm, Ralf
Erschienen2008
Umfang101 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2008
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Ribonucleoproteinpartikel / Prozessierungs-Körper / mRNA Lokalisierung / Dendriten / hippokampale Neurone / Nukleofektion / Transfektionseffizienz
Schlagwörter (EN)Ribonukleoproteinparticle / Processing-body / mRNA localization / dendrites / hippocampal neurons / nucleofection / transfection efficiency
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-3386 Persistent Identifier (URN)
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Investigating the role of different ribonucleoprotein particles in dendritic mRNA localization and translational control [1.52 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die dendritische Lokalisierung von mRNAs und deren Translation an stimulierten Synapsen trägt zur erfahrungsabhängigen Umstrukturierung von Synapsen und dadurch zur Entstehung von Langzeiterinnerung bei.

Lokalisierte mRNAs werden in translationell reprimiertem Zustand in distale Dendriten transportiert. Dieser Transport geschieht in speziellen Ribonukleoproteinpartikeln (RNPs). Eine neue Studie in der Fruchtfliege warf die Hypothese auf, dass auch Prozessierungs-Körper (P-Körper) in der Translations-kontrolle dendritischer mRNAs beteiligt sein könnten. Zudem spielen P-Körper eine wichtige Rolle bei der Degradierung von mRNAs. Dies warf die interessante Frage auf, ob dendritische Transport RNPs und P-Körper einen hohen Anteil an gleichen molekularen Bestandteilen aufweisen oder unterschiedlich aufgebaut sind.

Um diese Frage zu beantworten, führte ich Kolokalisationsstudien zwischen Transport RNP und P-Körper Markerproteinen durch. Dazu galt es zunächst die Spezifität der verwendeten Antikörper auszutesten. Hierzu wurden die entsprechenden Markerproteine durch siRNAs in Zellen ausgeschaltet und die Zellextrakte via Western-blot analysiert. Da die Anzahl untransfizierter Zellen das Resultat verfälscht, war ein erstes wichtiges Ziel, eine Methode zu entwickeln, mit der man Neurone mit hoher Effizienz transfizieren kann. In dieser Dissertation gelang es mir, drei dafür wesentliche Parameter zu identifizieren: Die Menge und die Qualität der verwendeten Plasmid-DNA sowie die Verwendung neuer Nukleofektionsprogramme. Eine Kombination dieser drei Parameter führt zu einer Verbesserung der Transfektionseffizienz von 5% auf bis zu 80%. Im Folgenden gelang mir der Nachweis, dass Markerproteine für Transport RNPs und P-Körper weder kolokalisieren, noch in gemeinsamen Partikeln in Dendriten von Säugerneuronen transportiert werden. Jedoch zeigen videomikroskopische Analysen, dass P-Körper und Transport RNPs in dynamischer Art und Weise interagieren können. Dieses sogenannte docking ist ein sehr oft beobachtetes Phänomen und wird in 40% aller P-Körper in Dendriten beobachtet. Chemisch induzierte neuronale Aktivierung führt zu einem Verlust von 70% aller dendritischen P-Körper. Dies könnte bedeuten, dass sich dendritische P-Körper als Antwort auf synaptische Stimulierung zeitweilig auflösen. Meine Daten unterstützen die Hypothese, dass dendritisch lokalisierte mRNAs möglicherweise in P-Körper gespeichert werden und bei Aktivierung von Synapsen aus den P-Körpern freigesetzt und anschließend translatiert werden.

Zusammenfassung (Englisch)

The dendritic localization of mRNAs and their subsequent translation at stimulated synapses contributes to the experience-dependent remodeling of synapses and thereby to the establishment of long-term memory. Localized mRNAs are transported in a translationally silent manner to distal dendrites in specific ribonucleoprotein particles, termed transport RNPs. A recent study suggested that Processing bodies (P-bodies), which have recently been identified as sites of RNA degradation and translational control in eukaryotic cells, may participate in the translational control of dendritically localized mRNAs in Drosophila neurons. This study raised the interesting question whether dendritic transport RNPs are distinct from P-bodies or whether these structures show a significant overlap in their molecular composition also in mammalian neurons. To answer this question, I performed co-localization studies with transport RNP and P-body markers. The specificity of the affinity-purified antibodies used in this study was tested in cells where the respective antigen was down-regulated by small interfering RNAs (siRNAs). As large proportions of untransfected cells compromise the assessment of the efficiency of the down-regulation, for example by Western blotting, it was important to develop a protocol that allows highly efficient transfection of neurons via nucleofection. In this thesis, I identified three important parameters that proved especially useful for chronically difficult to transfect shRNA-encoding plasmids:

the amount and quality of the plasmid DNA used as well as the use of new nucleofection programmes. Combining these parameters increased the rate of transfected cells from less than 5% to up to 80%. These improvements allowed me to test the functionality of the shRNA-encoding plasmids and to confirm the specificity of the used markers. Subsequently, my experiments showed that P-body and transport RNP markers do not co-localize and are not transported together in the same particles in dendrites of mammalian neurons. Time-lapse videomicroscopy analyses reveal, however, that P-bodies and transport RNPs can interact in a dynamic manner via docking. Docking is a frequent event involving as many as 40% of all dendritic P-bodies. Moreover, I found that chemically induced neuronal activity results in a 70% decrease in the number of P-bodies in dendrites suggesting that they disassemble upon synaptic stimulation. My data therefore lend support to the hypothesis that dendritically localized mRNAs might be stored in P-bodies and be released and possibly translated when synapses become activated and undergo plastic changes associated with the establishment of memory.