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Title
A novel tool for the rapid isolation and sensitive multiplex analysis of lipid raft components with single cell resolution / submitted by Philipp Schatzlmaier
AuthorSchatzlmaier, Philipp
CensorStockinger, Hannes
Published2015
DescriptionXII, 122 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2015
Annotation
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)lipid rafts / Durchflusszytometrie / Zell-Signalgebung / T-Zell-Aktivierung / Einzelzellanalyse / Detergens / CD3 / CD4 / CD8 / Lck
Keywords (EN)lipid rafts / detergent-resistant membranes / flow cytometry / T-cell signaling
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-394 Persistent Identifier (URN)
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A novel tool for the rapid isolation and sensitive multiplex analysis of lipid raft components with single cell resolution [30.36 mb]
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Abstract (German)

Die "lipid rafts"-Theorie beschreibt eine heterogene Klasse dynamisch organisierter Mikrodomänen der Zellmembran mit fundamentaler Bedeutung für zelluläre Homöostase, Differenzierung und Signalgebung.

Moleküle und Dynamiken der "lipid rafts"-Domänen werden mittels sehr unterschiedlicher Methoden untersucht: diese reichen von Phasentrennungsanalyse über biochemische Fraktionierung von Detergens-resistenten Membranfraktionen bis zur hochauflösenden Nanoskopie lebender Zellen. Detergens-basierte Standardprotokolle zur Membranfraktionierung liefern wichtige quantitative Informationen zur Membranorganisation, benötigen jedoch einige Tage und Dutzende oder Hunderte Millionen Zellen an Ausgangsmaterial, was die Analyse seltener Zellen und heterogener Zellpopulation erschwert oder gänzlich ausschließt. Weiters wird die biologisch relevante Information einzelner Zellen zerstört. Im Zuge dieser Arbeit entwickelten wir eine robuste und dabei rasch durchführbare, Detergens-basierte Methode um multiple "lipid rafts"-assoziierte Membrankomponenten simultan und hochsensitiv mittels Durchflusszytometrie auf der Ebene einzelner Zellen zu quantifizieren.

Unser einfach zu implementierender Ansatz ermöglicht die präzise Erfassung von "lipid rafts"-Molekülen und deren Dynamiken in Immunzellen, wenngleich er zur Analyse von Signalgebung und Differenzierung praktisch aller in Laboratorien untersuchter Säugetierzellen eingesetzt werden kann. Überdies ist unser Protokoll besonders zur Analyse von peripher mit "lipid rafts" assoziierten Komponenten und komplexer biologischer Proben geeignet.

Abstract (English)

The lipid rafts concept describes a heterogeneous class of dynamic cell membrane microdomains that are integral to cell homeostasis, differentiation and signaling. Fundamentally different techniques are employed to study lipid raft molecules and dynamics, including phase separation analysis, biochemical fractionation of detergent-resistant components, and live-cell super-resolution imaging. While current day-long approaches based on detergent-resistance of membrane fractions can provide a valuable and quantitative assessment of membrane order, they require 10^7 or more cells for readout - which excludes rare cells or heterogeneous cell populations from comprehensive analysis - and destroy single cell information.

We thus developed a rapid and reliable detergent- and flow cytometry-based method, which allows for multidimensional and sensitive high throughput quantitation of lipid raft-associated components with single cell resolution. As demonstrated, our easy-to-implement approach enables - but is not limited to - the precise assessment of lipid raft components and their dynamics associated with immune cell signaling and differentiation. It is uniquely suited for the accurate assessment of weakly raft-associated factors and complex biological samples.