Titelaufnahme

Titel
Single Particle 3D Reconstruction of Rhinovirus Uncoating Intermediates: Geometry of Membrane Attachment and Conformation of the RNA Genome
Verfasser / VerfasserinKumar, Mohit
Begutachter / BegutachterinBlaas, Dieter
Erschienen2014
Umfang135 Bl.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Rhinovirus / HRV2 / Cryo-electron microscopie
Schlagwörter (EN)Rhinovirus / HRV2 / Cryo-electron microscopy
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5223 Persistent Identifier (URN)
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Single Particle 3D Reconstruction of Rhinovirus Uncoating Intermediates: Geometry of Membrane Attachment and Conformation of the RNA Genome [18.4 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Humane Rhinoviren (RVs) werden dem Genus Enterovirus, Familie Picornaviridae zugeordnet.

Diese Viren verursachen Rhinitis, gemeinhin als Schnupfen bezeichnet. Um in die Wirtszelle zu gelangen binden RVs an bestimmte Rezeptoren, die an der Zellmembran präsentiert werden, es folgt eine Aufnahme in die Zelle mittels Endozytose. Um aus Endosomen in das Zytoplasma der Zelle zu gelangen wird folgender Mechanismus vorgeschlagen: Der saure pH der späten Endosomen (ca. pH 5,4) induziert strukturelle Änderungen der Virusproteine und/ oder des Rezeptors die dazu führen, dass das Virus vom Rezeptor abfällt. Des Weiteren werden durch die strukturellen Änderungen Proteine, bzw. Proteinsequenzen, die im Inneren des nativen Virus geschützt sind externalisiert (VP4 und der N-terminus von VP1).

Durch die Präsentation dieser hydrophoben Sequenzen kann das Viruspartikel mit über eine der 2-fachen Symmetrieachsen an die endosomale Membran binden und einen Kanal oder eine Pore in der Membran bilden um das Genom in das Zytoplasma zu transportieren. Wie und zu welchem Zeitpunkt in diesem Prozess die RNA in diese Pore gelangt, und wie durchgängige Poren geschaffen werden ist bislang ungeklärt. Es konnte gezeigt werden, dass das verwandte Poliovirus, sowohl in seiner nativen Form (160S Partikel) als auch in der Übergangsform (135S Partikel), an Lipidmembranen bindet und für Ionen durchlässige Kanäle bilden kann, die dem Transfer ihres Genomes dienen könnten (Tosteson & Chow, 1997). Mittels Kryo- Elektronenmikroskopie (Kryo- EM) konnten wir erstmals ein Picornavirus A-partikel (HRV2 135S Partikel), das ohne die Hilfe eines Rezeptors über einer seiner 2-fachen Symmetrieachsen an eine liposomale Membran gebunden ist mit einer Auflösung von etwa 37 Å visualisieren (Kumar & Blaas, 2013). Unsere Fluoreszenz Korrelations-Spektroskopie Daten zeigen, dass das Virus, bei Reneutralisation des pH Wertes, ihre RNA durch die Membran in das Innere der Liposomen transferieren kann (nicht veröffentlichte Daten). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu dem Modell für Genomtransfer, das von Butan et al. anhand von Poliovirus und Rezeptor- tragenden Liposomen präsentiert wurde. In diesem Modell wird die Pore für den RNA-Transfer an der quasi- 3- fachen Symmetrieachse durch eine irreversible Konformationsänderung der benachbarten VP1 Proteine gebildet (Butan et al., 2014). In unserem Modellsystem verwenden wir keine Rezeptoren, dadurch sind die Resultate wesentlich eindeutiger. Unsere Ergebnisse unterstützen ein zuvor vorgeschlagenes Modell des Genomtransfers von minor group RVs, demzufolge das Viruspartikel bei Senkung des endosomalen pH Wertes vom Rezeptor dissoziiert und sich zu einem intermediären A-Partikel entwickelt. Dieses A-Partikel lagert sich an das Innere der endosomalen Membran an und bildet in dieser Kanäle durch die das Genom in das Zytoplasma transportiert werden kann (Konecsni et al., 2009). Des Weiteren konnten wir beobachten, dass verschiedene Bedingungen (Erhitzen oder pH Wert Senkung) unterschiedliche Übergangsformen bei HRV2 bedingt. Durch Psoralen vernetztes und erhitztes Rhinovirus bildete eine Übergangsform, die bei Visualisierung durch Kryo- Elektronenmikroskopie im Inneren eine stabförmige Dichte aufweist. 3D- Rekonstruktion (3DR) dieser Daten zeigt, dass die RNA in dieser Übergangsform dicht gepackt ist und in der Nähe einer 2-fach Symmetrieachse sowie einer gegenüberliegenden 3-fach Symmetrieachse das Kapsid kontaktiert (Harutyunyan et al., 2013). Als Austrittspforte für die RNA kommt eine der großlumigen Poren, die an der 2-fach Symmetrieachse entstehen in Frage. Kryo- EM und Röntgenstrukturen des ohne Psoralen induzierten Übergangszustandes (135S A-Partikel) weisen andere Interaktionen der RNA mit dem Kapsid auf (Pickl-Herk et al., 2013). Der genaue Mechanismus, wie die RNA in die Membranpore findet und das Kapsid verlässt bleibt Gegenstand weiterer Forschung

Zusammenfassung (Englisch)

Human rhinoviruses (RVs) belong to the genus Enteroviruses, family Picornaviridae and are known to cause the common cold widely in children and adults. Upon infection, RVs bind to the specific receptors present at the cell membrane and are internalized into the endosomes. It is hypothesized that in case of minor group RVs the acidic pH (<= 5.4) of the endosome causes structural changes in the virus and/or receptor/s, and, as a result, the virus detaches from its receptor, expels its internal capsid protein VP4 along with externalization of the N-terminal sequences of VP1. This hydrophobic particle then binds to the inner endosomal membrane via one of its 2-fold axis to create a channel or pore in the membrane for the easy delivery of its genome into the cytoplasm. However, it is still not clear how and where, on transition from the native to the empty particle, the RNA finds these channels and how the presumably contiguous channels in the membrane are being formed.

It has been shown for both the poliovirus native (160S) and the intermediate (135S) particle that, they are capable of binding to the lipid membrane and to form an ion permeable channel that might be involved in translocation of their genome (Tosteson & Chow, 1997). We have shown, for the first time, a membrane bound picornavirus A-particle (i.e. HRV2 135S A-particle), bound to the liposomal membrane in absence of the receptor/s via one of its 2-fold axes at 37 Å resolution by cryo-electron microscopy (Kumar & Blaas, 2013). Our FCS experiments have shown that on re-acidification these membrane-bound HRV2 A-particles are capable of transferring their RNA through the membrane barrier, into the lumen of the liposomes (unpublished data). These results might contradict the uncoating model published by Butan et al. for poliovirus bound to receptor-decorated liposomes. The model states that the hole for RNA egress is formed by irreversibly shifting of neighboring VP1's to the quasi 3-fold axes in a gear shift movement (Butan et al., 2014).

Since in our system we do not use receptors, it is much cleaner. It supports the earlier proposed model of uncoating of minor group RVs, where on acidification, the internalized virus detaches from the bound receptor/s, forms an intermediate A-particle that then attaches to the inner endosomal membrane for the formation of channels and for the easy delivery of its genome into the cytoplasm (Konecsni et al., 2009). We also found that acidified and heated native HRV2, respectively, generate different uncoating intermediates. Psoralen cross-linked and heated native HRV2 formed particles containing rod-like density. The cryo-EM 3-dimensional reconstruction (3DR) of these particles indeed showed the condensed form of RNA inside the icosahedral capsid, attached near to a 2-fold and to a 3-fold axis at the opposite sides (Harutyunyan et al., 2013). Although the cryo-EM and the X-ray structures of the HRV2 intermediate135S A-particle showed different interactions of the viral genome with the inner capsid wall, it is still a conundrum how this encapsidated RNA finds the channel and escape from the capsid (Pickl-Herk et al., 2013). The large size pores near to the 2-fold axes strongly suggest it being the exit site for the RNA.