Titelaufnahme

Titel
Molecular background of Fabry disease / submitted by Anita Jallitsch-Halper
Verfasser / VerfasserinJallitsch-Halper, Anita
Begutachter / BegutachterinFödinger, Manuela
Erschienen2012
Umfang139 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Morbus Fabry / GLA Gen / genetische Varianten / molekulare Diagnostik / Populationsgenetik / Haplotypen
Schlagwörter (EN)Fabry disease / GLA gene / genetic variants / molecular diagnosis / population genetics / haplotypes
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-6936 Persistent Identifier (URN)
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Zusammenfassung (Deutsch)

Morbus Fabry ist eine X-chromosomal vererbte, lysosomale Speichererkrankung, welche durch eine reduzierte oder fehlende Aktivität des Enzyms alpha-Galaktosidase A verursacht ist. Eine Diagnosestellung im Anfangsstadium ist unbedingt notwendig um mittels Enzymersatztherapie Spätfolgen und Komplikationen verhindern zu können. Die konventionelle Diagnostik bei Morbus Fabry umfasst sowohl biochemische als auch genetische Untersuchungen. Letztere sind in der Regel auf Sequenzanalysen der Exons, sowie der Exon-Intron Grenzen im GLA Gen beschränkt. Um jene im Zuge der genetischen Diagnostik gefundenen Mutationen interpretieren zu können (pathogen oder nicht-pathogen), muss die natürliche Genvariabilität bei gesunden Individuen bekannt sein.

Daten dazu sind derzeit nicht vorhanden. Um diese Lücke zu füllen, wurde in der aktuellen Studie das gesamte GLA Gen von 100 Gesunden auf das Vorhandensein von Mutationen untersucht. Das Studienkollektiv umfasste 52 Frauen und 48 Männer (= 152 untersuchte X-Chromosomen) bei denen ein Morbus Fabry mittels biochemischer und klinischer Kriterien ausgeschlossen worden war. Die Mutationsanalyse wurde mit einem Sequenzierprotokoll durchgeführt, welches alle Exons, die Introns und die Promotorregion des GLA Gens einschloss. Die identifizierten Mutationen wurden im Anschluss einer Genotyp- und einer Haplotyp-Analyse unterworfen. Ferner wurde bei 2 verwandten Patientinnen mit Verdacht auf Morbus Fabry, bei denen die konventionelle Sequenzanalyse negativ ausfiel, das gesamte GLA Gen mit dem neuen Protokoll analysiert.

Zusätzlich wurden die Patientinnen mittels Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA®) analysiert und die mRNA des GLA Gens einer Sequenzanalyse zugeführt. Bei der Mutationsanalyse der gesunden Studienpopulation wurden insgesamt 46 Individuen mit mindestens einer GLA Sequenzvariante identifiziert. Insgesamt wurden 39 Varianten (35 "single nucleotide" Varianten, 4 Strukturvarianten) detektiert, welche vor allem in den Introns lokalisiert waren. Dreizehn Varianten sind bis dato weder in der Literatur noch in diversen Datenbanken publiziert. Im Exon 5 fand sich eine Mutation (g.10135A>G), welche einen Aminosäureaustausch im Kodon 215 (p.Asn215Ser) verursacht. Diese Mutation kann mit einer milden, kardialen Form des Morbus Fabry assoziiert sein. Die Frequenzen des zweithäufigsten Allels ("minor allele frequencies") in der untersuchten Studienpopulation lagen zwischen 0.7 und 16.4%. Die Genotyp-Analysen zeigten, dass die beobachteten Verteilungen nicht signifikant von der erwarteten Verteilung gemäß des Hardy-Weinberg Equilibriums (p>0.001) abweichen.

Diese Ergebnisse bestätigen, dass weder Genotypisierungsfehler, noch Populationssubstrukturen im gesunden Kollektiv vorhanden waren. Mittels paarweiser Korrelationsanalyse wurden einige der Varianten im starken "linkage disequilibrium" identifiziert. Ferner wurde ein Haplotypenblock zwischen den Loci g.4572 und g.10115 ( 5kb) geortet. Die Sequenzanalyse der beiden Patientinnen mit Verdacht auf Morbus Fabry ergab eine Variante im Intron 3 (g.7636C>T). Da diese Mutation sowohl in der gesunden Population dieser Studie als auch in anderen gesunden Kollektiven beschrieben wurde, kann davon ausgegangen werden, dass es sich um eine nicht-pathogene Variante handelt. Die MLPA und mRNA Analysen waren bei beiden Patientinnen negativ.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass es sich bei der vorliegenden Studie um die ersten systematischen Daten von Mutationen im GLA Gen bei gesunden Individuen handelt. Diese Informationen sind für die Interpretationen genetischer Untersuchungen bei Patienten von größtem Interesse. Zudem wurde hier ein Sequenzierprotokoll entwickelt, welches das gesamte GLA Gen abdeckt und somit für die Mutationsanalyse in den Exons, den Introns und in der Promotorregion eingesetzt werden kann.

Zusammenfassung (Englisch)

Fabry disease is an X-linked progressive lysosomal storage disorder caused by a deficient activity of the enzyme alpha-galactosidase A. Diagnosis of Fabry disease at an early stage is mandatory for a well-timed administration of enzyme replacement therapy in order to prevent severe organ damage. Conventional diagnostic work-up includes biochemical analyses and genetic testing. The latter is usually restricted to sequence analysis of exons and exon/intron boundaries of the GLA gene. To correctly assign the detected mutations as pathogenic or non-pathogenic, the GLA gene variability of healthy individuals most be known. However, no such data are available. To fill this void, the entire GLA gene of 100 healthy individuals was analyzed for the presence of mutations. The healthy population included 52 females and 48 males in whom Fabry disease was excluded based on biochemical and clinical criteria (152 X-chromosomes). Mutation analysis was accomplished by a sequencing protocol covering all exons and introns as well as the promoter region of the GLA gene. The mutations identified were subjected to genotype and haplotype analysis. Furthermore, in two related female patients with suspected Fabry disease who tested negative by conventional sequencing the protocol described herein was used for mutation analysis in the entire GLA gene. Additionally, in these cases Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA®) and mRNA sequence analyses were performed. Sequence analyses among the 100 healthy individuals revealed 46 subjects with at least one variant in the GLA gene. In total 39 different GLA variants were identified and represented either single nucleotide or structural variants (35 and 4 variants, respectively). The variants were mainly located in intronic regions. Thirteen of 39 variants represented novel mutations. One probable pathogenic mutation (g.10135G>A) was identified in exon 5. This mutation results in an p.Asn215Ser substitution and has been reported to be associated with a mild, mainly cardiac form of Fabry disease. The minor allele frequencies among the 152 tested X-chromosomes ranged between 0.7 and 16.4%. Genotype analysis revealed that the observed genotype distributions did not deviate significantly from the expected deviations based on the Hardy-Weinberg equilibrium (p>0.001). This result excluded the presence of genotyping errors or population substructures. The most polymorphic genotype was identified in two unrelated females, showing 17 different variants. Pair-wise correlation analysis revealed several variants in strong linkage disequilibrium and one haplotype block, between the GLA loci g.4572 and g.10115 ( 5kb), was predicted. Among the two female patients with suspected Fabry disease sequence analysis of all exons and introns as well as of the promoter region revealed a single point mutation in intron 3 (g.7636C>T). This mutation was also present among healthy individuals and thus could be assigned as a non-pathogenic variant. MLPA and mRNA analyses were negative in both patients.

In conclusion, this study is the first to provide systematic information about mutations that are present in the GLA gene of healthy individuals.

These data are of utmost importance for interpretation of results obtained from sequence analyses among Fabry patients. Moreover, a sequencing protocol covering the entire GLA gene is now available which allows for mutation detection in exons, introns and in the promoter region of Fabry patients.