Titelaufnahme

Titel
Understanding the molecular mechanism of histone H2B ubiquitination: a biochemical study.
VerfasserTurco, Eleonora
Begutachter / BegutachterinKöhler, Alwin
Erschienen2015
Umfang105 Bl.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2015
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)B Ubiquitinierung / Rad6 / Bre1
Schlagwörter (EN)B ubiquitination / Bre1 / Rad6 / ligases / gene expression
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-6131 Persistent Identifier (URN)
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Understanding the molecular mechanism of histone H2B ubiquitination: a biochemical study. [5.83 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Post-translationale Modifikationen von Histonen spielen eine entscheidende Rolle in der dynamischen Verpackung von DNA und Proteinen in eine definierte Chromatinstrucktur. Als eine dieser möglichen post-translationalen Modifikationen reguliert die Histon-Ubiquitinierung wichtige genomische Funktionen wie den Austausch von Histonen, DNA Reparatur und Genexpression. So konnte zum Beispiel durch Expressionsstudien sowie genetische Untersuchungen in der Hefe S.

cerevisiae gezeigt werden, dass die Ubiquitinierung von H2B an der Regulation von Transkriptionsinitiation und -elongation beteiligt ist.

Verantwortlich für die Ubiquitinierung von Histon H2B sind das E2 Ubiquitin-konjugierende Enzym Rad6 sowie die E3 Ubiquitinligase Bre1, deren Bedeutung in diesem Prozess sowohl in in vivo als ach in vitro Experimenten gezeigt wurde. Wie jedoch Bre1 die Aktivität von Rad6 steuert und dabei sicherstellt, dass nur ein Ubiquitinmolekül auf H2B übertragen wird, konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden. Ziel dieser Studie war es, die molekularen Mechanismen der Histon H2B Ubiquitinierung zu identifizieren. Dazu sollte die Reaktion unter definierten in vitro Bedingungen mit rekombinant expremierten Komponenten rekonstruiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die RING Domäne von Bre1 die minimal funktionelle Einheit des Proteins darstellt, die Rad6 bindet und die spezifische Monoubiquitinierung von H2B bewerkstelligen kann. Darüberhinaus konnten wir eine Ansammlung von basischen Aminosäuren innerhalb der RING Domäne von Bre1 identifizieren, welche für die Substraterkennung essentiell ist. Die sogenannte RBD (Rad6 Binding Domain), eine weitere Proteindomäne von Bre1, bindet Rad6 an der der Enzymatischen Tasche gegenüberliegenden Seite und verstärkt Aktivität von Rad6. Des Weiteren weisen die hier gezeigten Daten daraufhin, dass es auf der Oberfläche der Nukleosomen weitere, Aminosäuren gibt, die zwar nicht an der Bindung von Bre1 beteiligt sind, den Transfer von Ubiquitin jedoch möglicherweise direkt steuern. Zusammenfassend ermöglichen die hier gezeigten Daten eine detaillierte Darstellung der molekularen Mechanismen, der H2B Ubiquitinierung, in der verschiedene Domänen von Bre1 zusammenwirken um die Aktivität und Substratspezifität von Rad6 zu steuern. Darüberhinaus ermöglichen sie eine präzise Charakterisierung der Binding von Bre1, Rad6 und dem Nukleosom und zeigen die Relevanz einer effizienten und kontrollierten Ubiquitinierung von H2B sowohl in vitro als auch in vivo.

Zusammenfassung (Englisch)

Post-translational modifications of histones help shaping the chromatin fiber ensuring a dynamic balance between chromatin packaging and accessibility. Among them, histone ubiquitination regulates important genomic functions like histone turnover, DNA repair and gene expression. In particular, histone H2B ubiquitination was linked to transcription initiation and elongation by genetic studies and mRNA quantification data in yeast. The E2 ubiquitin-conjugating enzyme Rad6 and the E3 ligase Bre1 were identified a decade ago as the enzymes responsible for histone H2B ubiquitination in vivo and in vitro.

However, little is known about how Bre1 activates Rad6 and limits its activity to monoubiquitination of a specific lysine residue on H2B. In this study, we set out to define the molecular mechanism of histone H2B ubiquitination by reconstituting the reaction in vitro with recombinant components. We show that the RING domain represents the minimal functional unit of Bre1, which is able to specifically monoubiquitinate H2B lysine 123, upon interaction with Rad6. Moreover, we identify a patch of basic residues in Bre1 RING domain, which mediates substrate recognition. Remarkably, a second Bre1 domain, named Rad6 binding domain (RBD), interacts with Rad6 "backside" and enhances its ubiquitin conjugating activity. Finally, we suggest that nucleosome surface residues different from Bre1 interacting surface might play a direct role in ubiquitin transfer. Taken together, our data shed light on the molecular details of histone H2B ubiquitination reaction, in which different Bre1 domains cooperate to control Rad6 activity and define substrate specificity. Furthermore we provide a detailed characterization of the binding interfaces between Bre1, Rad6 and the nucleosome, and we show their relevance for efficient histone H2B ubiquitination both in vitro and in yeast cells.