Titelaufnahme

Titel
Evaluation of microglia - macrophages as potential targets for pharmacological gene therapy in X-linked adrenoleukodystrophy / submitted by Zahid Muneer
Verfasser / VerfasserinMuneer, Zahid
Begutachter / BegutachterinBerger, Johannes
Erschienen2015
UmfangXVIII, 115 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2015
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)ABC Transporter / ABCD1 / ABCD2 / Lipidstoffwechsel / Makrophagen / Mikroglia / Maus-Peritonealmakrophagen / Peroxisom / Retinoide / X-chromosomale Adrenoleukodystrophie
Schlagwörter (EN)ABC transporter / ABCD1 / ABCD2 / Lipid metabolism / Macrophages / Microglia / Mouse Peritoneal Macrophages / Peroxisome / Retinoids / X-linked adrenoleukodystrophy
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-2277 Persistent Identifier (URN)
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Evaluation of microglia - macrophages as potential targets for pharmacological gene therapy in X-linked adrenoleukodystrophy [4.71 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

X-chromosomale Adrenoleukodystrophie (X-ALD) ist eine peroxisomale Erbkrankheit mit großer klinischer Heterogenität. In der schwersten Verlaufsform kommt es im Kindesalter zu einer entzündlichen Demyelinisierung, die ohne Behandlung innerhalb weniger Jahre zum Tod des Patienten führt. In der milderen Verlaufsform sind Gangstörungen und oder Nebennierenrindeninsuffizienz oftmals die einzigen Symptome. Die genetische Ursache für alle Verlaufsformen sind Mutationen im ABCD1-Gen.

ABCD1 kodiert für den peroxisomalen ATP-abhängigen Transporter ABCD1.

Weil dieser Transporter CoA-aktivierte überlangkettige Fettsäuren zum Abbau in die Peroxisomen befördert, resultiert ABCD1-Defizienz in einer selektiven Akkumulierung dieser Fettsäuren. ABCD2, ein dem ABCD1 verwandter peroxisomaler Transporter, kann nach Überexpression in Zellkultur und in Mausmodellen das Fehlen von ABCD1 kompensieren.

Monozyten/Makrophagen scheinen bei der entzündlichen Form von X-ALD eine wesentliche Rolle zu spielen.

In der vorliegenden Dissertation wurde der Einfluss von ABCD2 auf primäre Makrophagen von X-ALD Mausmodellen untersucht. Dazu wurden Maus-Peritoneal-Makrophagen(MPM) von Abcd1-defizienten, Abcd2-defizienten, Abcd1/Abcd2-doppeldefizienten und Kontroll-Mäusen verwendet. Mittels quantitativer RT-PCR konnte gezeigt werden, dass die MPM, im Gegensatz zu humanen Monozyten und Makrophagen, eine substanzielle Menge an Abcd2 mRNA aufweisen, die etwa halb so hoch ist wie die der Abcd1 mRNA. Die MPM der Abcd1-defizienten Maus zeigten eine Verdoppelung der Menge der überlangkettigen Fettsäure C26:0. Die MPM der Abcd2-defizienten Maus waren in ihren C26:0-Werten von den Kontrolltieren nicht zu unterscheiden. Die MPM der Abcd1/Abcd2-doppeldefizienten Mäuse zeigten jedoch eine 13-14fach höhere Menge an C26:0 als die Wildtyp-Kontrollen. Auch die peroxisomale beta-Oxidation zeigte in den MPM Abcd1/Abcd2-doppeldefizienten Mäusen einen weit größeren Defekt als in der Abcd1-defizienten Maus. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die relativ geringe Menge an Abcd2 mRNA in MPM bereits ausreicht, um bei Abcd1-Defizienz einen viel stärkeren metabolischen Defekt zu verhindern.

In einem nächsten Schritt wurde versucht die Abcd2 Expression in MPM durch Induktion der Transkription weiter zu aktivieren. Retinoide konnten die Abcd2 mRNA Menge erhöhen. HDAC-Inhibitoren, wie SAHA, zeigten weder alleine eine prominente Erhöhung der Abcd2-mRNA-Menge noch wirkten sie synergistisch in Kombination mit Retinoiden.

Zudem wurden transgene Mäuse generiert, welche die humane ABCD2 cDNA unter dem Iba1-Promotor in Mikroglia/Makrophagen überexprimieren sollten, um zu untersuchen, ob dies den klinischen Phänotyp im X-ALD Mausmodell verändern kann. Die ABCD2-Expressionsstärke war jedoch in allen erhaltenen transgenen Linien zu gering, um diese Fragestellung effizient untersuchen zu können.

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass bereits eine moderate Induktion von ABCD2 einen positiven Effekt auf den metabolischen Defekt der Makrophagen in X-ALD haben dürfte.

Zusammenfassung (Englisch)

X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inherited, neurodegenerative, peroxisomal disorder. X-ALD manifests with different clinical presentations varying from the highly progressive childhood cerebral ALD, involving demyelination and inflammation of the brain, to slowly progressive adrenomyeloneuropathy, involving the spinal cord and peripheral nerves. All phenotypes of X-ALD are caused by mutations in the ABCD1 gene encoding the ATP-binding cassette (ABC) transporter ABCD1. The ABCD1 protein is localized in the peroxisomal membrane, where it mediates the transport of CoA esters of very long-chain fatty acids (VLCFA) into peroxisomes. In X-ALD, peroxisomal beta-oxidation of saturated VLCFA is impaired resulting in their accumulation in tissues and plasma of patients and Abcd1-deficient mice. Elevated levels of C26:0 serve as a major diagnostic biomarker for XALD. ABCD2, another peroxisomal membrane protein, is the closest homologue of ABCD1. Upon overexpression, ABCD2 can compensate for ABCD1 deficiency. Microglia and macrophages have emerged as important players in neuroinflammatory diseases and also in the pathophysiology of X-ALD.

Here, we used thioglycollate-elicited primary mouse peritoneal macrophages (MPM) from wild-type, Abcd1 and Abcd2 single and double-deficient mice to investigate the roles of ABCD1 and ABCD2 in VLCFA metabolism of macrophages. Both Abcd1 and Abcd2 mRNAs were present at low abundance but, in contrast to human monocytes, Abcd2 mRNA was easily detectable at about half the level of Abcd1 in MPM by qRT-PCR. No compensatory changes in the expression of Abcd1 or Abcd2 occurred in the absence of the other transporter. Expression of Elovl1, encoding the rate limiting enzyme for chain elongation of VLCFA, was not affected by Abcd1 and/or Abcd2 deficiency. Fatty acid levels determined by GC-MS revealed about twofold accumulation of VLCFA (C26:0) in Abcd1-deficient MPM compared with wild-type. Abcd2-deficient MPM did not accumulate VLCFA. However, a remarkable increase in VLCFA levels (C24:0 and C26:0) was found in Abcd1/Abcd2 doubledeficient MPM, with about 13-14 and 5-7 times higher C26:0/C22:0 ratios than in wild-type and Abcd1-deficient MPM, respectively. The rate of beta-oxidation for C26:0 was significantly decreased (by 38% when normalized to C16:0) in Abcd1-deficient MPM compared with wild-type controls. Whereas the beta-oxidation activity in single Abcd2-deficiency was in the normal range, the ratio C26:0/C16:0 showed a highly significant further decrease in Abcd1/Abcd2 double-deficient MPM compared with wild-type (71%) as well as Abcd1-deficient (54%) MPM. Thus, we conclude that the severely reduced capacity for beta-oxidation of saturated VLCFA caused the remarkably high accumulation of VLCFA in Abcd1/Abcd2 double-deficient MPM. These results show that compensation by moderate endogenous expression of Abcd2 prevents severe metabolic impairments in Abcd1-deficient murine macrophages.

We also investigated the efficacy of several different compounds for induction of Abcd2 in MPM. Treatment with various retinoic acid isomers or precursors resulted in up to fourfold increased Abcd2 mRNA levels.

Treatment of MPM with the HDAC inhibitor SAHA only slightly increased the Abcd2 mRNA levels. Combinatorial treatments of retinoids with SAHA had no synergistic effect on Abcd2 expression in MPM.

In addition, we generated transgenic mice aiming for overexpression of ABCD2 from the microglia/macrophage-specific Iba1 promoter to evaluate if increased amounts of ABCD2 selectively in microglia/macrophages can compensate for Abcd1 deficiency in X-ALD mice. However, none of the obtained transgenic mouse lines expressed sufficient levels of the transgene for conclusive evaluation of the role of ABCD2 in microglia and macrophages in vivo.

Taken together, these studies imply that a moderate induction of ABCD2 could have a positive effect on the metabolic defects in macrophages in X-ALD.