Titelaufnahme

Titel
Significance of the neurotensin receptor Na+/H+-exchanger 1 axis in human pancreatic cancer cells / submitted by Ulrike Olszewski
VerfasserOlszewski, Ulrike
Begutachter / BegutachterinHamilton, Gerhard
Erschienen2009
Umfang154 Bl. : Ill., zahlr. graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2009
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Pankreaskarzinom / Neurotensin / Na+/H+-Austauscher 1 / Signaltransduktion / Interleukin-8 / Mitogen- und stressaktivierte Kinase 1/2 / intrazellulärer pH / Genexpressionsanalyse / Metastasierung
Schlagwörter (EN)pancreatic cancer / neurotensin / Na+/H+ exchanger 1 / signal transduction / interleukin-8 / mitogen- and stress-activated kinase 1/2 / intracellular pH / gene expression analysis / metastasis
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-5207 Persistent Identifier (URN)
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Significance of the neurotensin receptor Na+/H+-exchanger 1 axis in human pancreatic cancer cells [2.37 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Pankreastumoren sind durch frühe Disseminierung und rasche Resistenzentwicklung gekennzeichnet, die zu einer sehr schlechten Prognose für die betroffenen Patienten führen. Neue, zielgerichtete Therapien konnten die niedrigen 5-Jahres-Überlebensraten nicht verbessern. Die Charakterisierung von Neuropeptiden als Wachstumsfaktoren für Pankreaskarzinomzellen stimulierte die Entwicklung entsprechender Inhibitoren. Insbesonders Neurotensin (NT) wirkt proliferativ in Tumorzelllinien, und der Neurotensinrezeptor-1 (NTR1)-Antagonist SR 48692 inhibiert das Wachstum von Tumorxenotransplantaten, jedoch wurde in einer klinischen Studie an Patienten mit kleinzelligem Lungenkarzinom keine signifikanten Ansprechraten beobachtet. Dennoch weist die Expression von NTR1 in bis zu über 90% der Pankreastumoren auf eine wichtige Rolle des NT - NTR-Systems in dieser Tumorentität hin. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie die Signifikanz der NT - NTR1-Signaltransduktion in BxPC-3, PANC-1 und MIA PaCa-2 Pankreastumorzelllinien und der NTR1-positiven Kolonkarzinomzelllinie HT-29 untersucht. Die funktionelle Expression von NTR1 wurde in allen Pankreaszelllinien durch die Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration in Reaktion auf das stabile NT-Analogon Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) nachgewiesen. Der Anteil der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus und die Proliferation der Pankreaslinien waren durch das NT-Analogon in beschränktem Ausmaß erhöht. Im Gegensatz zur Expression des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) erreichte die NTR1-Expression ein Maximum in konfluenten Kulturen mit ruhenden G1/0-Zellen im Falle der BxPC-3 und PANC-1 Zelllinien. Zusätzlich und im Gegensatz zum EGFR war die Expression von NTR1 vom extrazellulären pH abhängig und am Höchsten unter sauren Bedingungen.

Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) induzierte eine ausgeprägte intrazelluläre Alkalinisierung sowohl in BxPC-3 und PANC-1 als auch einer Reihe von Kolonkarzinomzelllinien unter Bedingungen, bei denen die Regulation des intrazellulären pH auf den weitverbreiteten Na+/H+-Austauscher (NHE1) beschränkt ist, im Gegensatz zu MIA PaCa-2 Zellen, die eine geringfügige Acidifizierung des Zytosols zeigten. Ähnliche Resultate wurden unter Verwendung von bikarbonat-gepufferten Lösungen erzielt. Der amilorid-sensitive Ionenaustausch durch den NHE1 wurde in BxPC-3 und PANC-1 durch Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) um den Faktor 2 - 2.7 stimuliert.

NHE1 wurde durch dieses NT-Analogon in BxPC-3, nicht aber in MIA PaCa-2 Zellen, vermehrt phosphoryliert. Screening von Änderungen in Phosphorylierungsmustern ausgewählter Proteine in Reaktion auf Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) ergab Unterschiede betreffend ERK1/2, p38[alpha] MAPK und mitogen- und stressaktivierter Kinase 1/2 (MSK1/2) in BxPC-3 und HT-29 Zellen, wohingegen in MIA PaCa-2 Zellen der Src- Signaltransduktionsweg aktiviert war. Die funktionelle Beteiligung von ERK1/2, p38[alpha] MAPK und MSK1/2 an der Regulation des intrazellulären pH wurde durch die Inhibition dieser Kinasen mittels PD 98059, SC68376 und Dimethylfumarat (DMF) nachgewiesen. Extrazelluläre Acidose erhöht die Produktion von Interleukin-8 (IL-8) , einem wichtigen prometastatischen Faktor für Pankreastumorzellen, und in guter Übereinstimmung damit stimulierte Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) die Freisetzung von IL-8 in BxPC-3 und PANC-1 in amilorid-sensitiver Weise und befähigte PANC-1 Zellen durch ein Gel aus extrazellulärer Grundsubstanz zu migrieren. Eine komplette Genexpressionsanalyse mittel Mikroarrays ergab spezifische Änderungen in exprimierter mRNA zwischen BxPC-3 und MIA PaCa-2 Zellen, mit Lys8-ψ-Lys9NT(8-13)-induzierter Hochregulation von Genen für Komponenten des Zytoskeletts und der Zelladhäsion, Hypoxieinduziertem Faktor-1[alpha] und glykolytischen Enzymen und anderen. Zusammenfassend ist die NT-NTR1 Signaltransduktion an der Induktion der Bildung eines erhöhten invasiven Potentials durch intrazelluläre Alkalinisierung / extrazelluläre Acidifizierung, Aktivierung von stressassoziierten MSK1/2-Signalwegen und der Produktion von IL-8 in Pankreaskarzinomzellen beteiligt, neben einem geringfügigen Effekt auf die Zellproliferation.

Zusammenfassung (Englisch)

Pancreatic cancer is characterized by early dissemination and rapid acquisition of drug resistance, resulting in dismal prognosis in patients. New targeted therapies failed to improve the low five-year survival rates. Characterization of neuropeptides as growth factors for pancreatic cancer cells stimulated interest in the development of suitable inhibitors. In particular, neurotensin (NT) stimulated proliferation of cancer cell lines, and the NT receptor 1 (NTR1) antagonist SR48692 was found to inhibit growth of tumor xenografts.

However, clinical application of SR48692 in small cell lung cancer failed to yield significant responses. Nevertheless, expression of NTRs in more than 90% of pancreatic tumors points to an important role of the NT - NTR system in this tumor entity. Therefore, the present study aimed at investigation of the significance of NT - NTR signaling by use of BxPC-3, PANC-1 and MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells and the NTR-positive HT-29 colon carcinoma cell line for comparison. Functional NTR1 that triggers release of intracellular Ca2+ upon binding of the stable NT analog Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) was confirmed in all pancreatic cancer cell lines. The fraction of cells in S phase was increased in response to the NT analog and proliferation of the pancreatic cancer cells stimulated to a limited extent. In contrast to epidermal growth factor receptor (EGFR), NTR1 expression was found to reach a maximum in confluent cultures of resting (G1/0 phase) BxPC-3 and PANC-1 cells. In addition, again unlike EGFR, expression of NTR1 proved to be dependent on extracellular pH with highest levels under acidic conditions. Accordingly, Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) induced marked intracellular alkalinization in BxPC-3, PANC-1 and a panel of colon cancer cell lines and slight acidification in MIA PaCa-2 cells under conditions that confine regulation of intracellular pH to the ubiquitously expressed Na+/H+ exchanger 1 (NHE1). Similar results were obtained in bicarbonate buffer. Amiloride-sensitive proton flux effected by NHE1 was stimulated 2 - 2.7-fold by Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) in BxPC-3 and PANC-1 cells, respectively. NHE1 was phosphorylated in response to the NT analog in BxPC-3, however, not in MIA PaCa-2 cells, and screening of changes in the phosphorylation status of selected proteins in response to Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) revealed participation of ERK1/2, p38[alpha] MAPK and mitogen- and stress-activated kinase 1/2 (MSK1/2) in responses of BxPC-3 and HT-29 cells, whereas Src signaling was stimulated in MIA PaCa-2 cells. Functional involvement of ERK1/2, p38[alpha] MAPK and MSK1/2 in stimulation of NHE1 activity by the NT analog was proved by inhibition of these kinases using PD 98059, SC 68376 and dimethyl fumarate (DMF), respectively. Extracellular acidosis stimulates production of interleukin-8 (IL-8), a crucial metastatic factor, in pancreatic cancer cells and, accordingly, Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) was found to stimulate secretion of IL-8 in BxPC-3 and PANC-1 cells in an amiloride-sensitive manner and to enable PANC-1 cells to migrate through an extracellular matrix gel. Genome-wide microarray analysis revealed distinct alterations in gene expression patterns of BxPC-3 and MIA PaCa-2 cells, with genes upregulated by Lys8-ψ-Lys9NT(8-13) in BxPC-3 cells coding for components of the cytoskeleton and cell adhesion, hypoxia-inducible factor-1[alpha] and glycolytic enzymes, among others. In conclusion, NT-NTR1 signaling was shown to contribute to the emergence of an increased invasive potential of pancreatic cancer cells by triggering intracellular alkalinization and localized extracellular acidification, activation of stress-associated MSK1/2 signaling and production of IL-8, besides its minor effect on cell proliferation.