Titelaufnahme

Titel
Characterization of the viral genome release mechanism of a common cold virus / submitted by Shushan Harutyunyan
Verfasser / VerfasserinHarutyunyan, Shushan
Begutachter / BegutachterinBlaas, Dieter
Erschienen2014
Umfang147 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie / Kapillarelektrophorese / Humane rhinoviren / HRV-A2 / HRV-B14 / reverse Transcription (RT)-(q)PCR / RNA / Mikrosomen
Schlagwörter (EN)Fluorescence correlation spectroscopy / capillary electrophoresis / Reverse Uncoating / Receptor / Rhinovirus / Picornavirus / endosomes / RNA / infection / Me-cleavage
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-6671 Persistent Identifier (URN)
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Characterization of the viral genome release mechanism of a common cold virus [14.53 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Humane rhinoviren (HRV) sind die Hauptursache für Schnupfen. Sie gehören zum Genus Enterovirus. Das HRV Genom ist einzelsträngige RNA (ssRNA), die am 5 Ende kovalent mit einem Protein (VPg) verbunden ist, und dessen 3 Ende aus einem poly(A) Trakt besteht. Um eine Zelle zu infizieren, muss die RNA aus der Hülle (dem Kapsid) freigesetzt werden und durch die Membran von Endosomen ins Zytoplasma transportiert werden. Studien von rhinovirus und dem verwandten poliovirus mittels Kryo- Elektronenmikroskopie weisen darauf hin, dass die genomische RNA das ikosahedrische Kapsid durch Poren, die an der 2 fachen Symmetrieachse entstehen, verlässt (Bostina et al, 2011; Garriga et al, 2012; Pickl- Herk et al, 2013). Der genaue Mechanismus des RNA-Ausstoßes ist allerdings unbekannt, des Weiteren ist unklar ob es eine bestimmte Direktionalität gibt. Um den Austritt der RNA zu untersuchen, wurden zwei verschiedene Bedingungen, die in vitro die Freisetzung der RNA induzieren, verwendet: Entweder Erhöhung der Temperatur auf 56C oder Senkung des pH-Wertes auf pH 5.2. Mittels Temperaturerhöhung konnten wir durch Zugabe der photoaktiven Substanz Psoralen, die RNA vernetzt, stabile Zwischenformen visualisieren. Diese Zwischenformen repräsentieren verschiedene Stadien der RNA Freisetzung. Die Freisetzung der RNA wurde mittels Negativfärbung durch Elektronenmikroskopie dokumentiert. Zwischenformen der RNA-Freisetzung zeigen stäbchenförmige Strukturen im Inneren des Kapsides, vermutlich RNA, die im Inneren zurückgehalten wird. Diese stäbchenförmigen Strukturen wurden nach pH Wert Senkung nicht beobachtet. Mithilfe mehrerer Methoden konnten wir bei HRV-A2, einem Vertreter der minor receptor group von HRV, sowohl in vitro als auch in vivo zeigen, dass das 3 Ende der RNA die virale Hülle zuerst verlässt. Die verwendeten Methoden waren: Fluoreszenz Korrelations Spectroscopie (FCS), reverse Transcription (RT)-(q)PCR und Kapillarelektrophorese (CE). Zellen wurden mit Viren infiziert die entweder intakte oder fragmentierte RNA enthielten. Mithilfe von Immunpräzipitation wurden die Zwischenformen isoliert, und im Kapsid verbliebene RNA wurde mittels RT-PCR identifiziert. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die RNA-Freisetzung in vivo deutlich schneller abläuft als in vitro, und sehr stark von der Temperatur, die während der Infektion der Zellen herrscht, abhängig ist. Wird Virus in vitro bei saurem pH inkubiert, bricht die RNA Freisetzung ab nachdem ca. 700 Basen des 3 Endes ausgestoßen wurden. Das weist darauf hin, daß ein Faktor in der Zelle die RNA- Freisetzung erleichtert. Testung verschiedener zellulärer Fraktionen zeigte, dass diese erleichternde Aktivität auf Mikrosomen beschränkt ist. Zu guter Letzt konnten wir auch an einem Vertreter der major group von rhinoviren (HRV-B14) zeigen, daß die RNA das Kapsid mit dem 3 Ende zuerst verlässt. Dies läßt vermuten, dass der Freisetzungsmechanismus für alle Serotypen von HRV identisch ist.

Zusammenfassung (Englisch)

Human rhinoviruses (HRV) are a major cause of the common cold and belong to the genus Enterovirus. Their single-stranded RNA (ssRNA) genome carries a covalently linked small protein (VPg) at its 5'-end and a poly(A) tail at its 3'-end. To infect a cell, this RNA must be released from the capsid and delivered through the endosomal membrane into the cytoplasm. For the related poliovirus (Bostina et al, 2011) and recently also for the minor group rhinovirus HRV-A2, data obtained by Cryo-electron microscopy (EM) point to the egress of genomic RNA through small pores formed in these subviral entities close to the 2-fold axis of the icosahedral capsid (Garriga et al, 2012; Pickl-Herk et al, 2013). However, the precise mechanism and a possible directionality of the RNA release from the virion remains unclear. To address the latter question, we have used two main in vitro triggers of uncoating, high temperature and low pH. In the case of heat treatment, we first optimized the conditions for the production of stable uncoating intermediates arrested at early stages of RNA release by using the RNA photo cross-linking reagent psoralen followed by exposure of the virus to 56C. Particles caught in the act of RNA exit were visualized by negative staining EM. This revealed rod-like internal structures presumably coming from RNA that was prevented from complete egress. However, this kind of particles was not detected when RNA release was triggered by incubation at pH 5.2. Using several methods (fluorescence correlation spectroscopy (FCS), RT- (q)PCR, capillary electrophoresis (CE)) we demonstrate that at least in the case of HRV-A2, viral RNA uncoating in vitro starts from 3'-end. Furthermore, directionality of RNA release also proved to be starting from the 3'-end in vivo. This was elucidated by infection of the cells with virus containing intact or metal-cleaved RNA followed by immunoprecipitation of the uncoating intermediate particles and detection of the remaining sequences of RNA inside the virion with RT- PCR. These experiments revealed that RNA release in vivo is prominently faster compared to in vitro release and is highly dependent on the temperature. When the virus was incubated at acidic pH, mimicking the conditions in the endosomal lumen, RNA release was halted after about 700 bases of the 3'-end had been externalized. This hinted at the existence of an additional facilitator of RNA release inside the cell. Further testing of the different cellular fractions from HeLa cells demonstrated that such activity was present only in microsomal fractions. Finally, we showed that in vitro uncoating of the major group rhinovirus HRV-B14 is also starting from the 3'-end, making it likely that our finding applies to all serotypes of HRVs.