Titelaufnahme

Titel
Posttranslational modifications and receptor complexes paralleling memory mechanisms / von Maryam Ghafari
VerfasserGhafari, Maryam
Begutachter / BegutachterinLubec, Gert
Erschienen2014
UmfangIX, 82 S. : graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
Quelle der Aufnahme
Mass spectrometrical identification of hippocampal NMDA receptor subunits NR1, NR2A-D and five novel phosphorylation sites on NR2A and NR2B J Proteome Res.2012 Mar.2;11(3):1891-6
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)NMDA-Rezeptor / AMPA-type glutamate rezeptors / post-translationale Modifikationen / Rezeptor Komplexen
Schlagwörter (EN)NMDA-Receptor / AMPA-type glutamate receptors / post-translational Modificatione / Receptor complex
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-4603 Persistent Identifier (URN)
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Posttranslational modifications and receptor complexes paralleling memory mechanisms [5.02 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Gehirn Rezeptoren im zentralen Nervensystem sind in synaptische Veränderungen involviert, welchen Lernen und Gedächtnis zugrunde liegenden. Obwohl Rezeptor-Untereinheiten mit der Erinnerungsbildung in Zusammenhang gebracht worden sind, stehen nur sehr eingeschränkte Daten über die Beteiligung der Rezeptorkomplexe zur Verfügung. Des Weiteren sind post-translationale Modifikationen für eine Reihe von Aktivitäten verantwortlich, z.B. für Genexpression, Aktivierung/Deaktivierung der Enzymaktivität, Proteinstabilität oder -Inaktivierung, Mediation von Wechselwirkungen zwischen Proteinen, und Modulation der Zellfunktionen durch Proteine im Zusammenhang mit Signal- und Regulierungsmechanismen.Neue Studien haben sich mit der Rolle post- translationaler Modifikationen (PTMs) in kognitiven Prozessen beschäftigt. Es ist gut dokumentiert, dass post-translationale Modifikationen, wie die Phosphorylierung von Serin, Threonin und Tyrosin, eine Rolle bei der synaptischen Plastizität des Gehirns, der Freisetzung von Neurotransmittern und dem Vesikeltransport spielen. Das Ziel unserer Studie bestand darin, zu zeigen, dass Rezeptor-hältige Komplexe, wie NMDAR, AMPAR im Hippocampus von Mäusen an Lern- und Gedächtnisleistungen beteiligt sind. In der Folge wurden die Zusammensetzung von Rezeptorkomplexen, ihre post-translationalen Modifikationen und ihre Bindungspartner untersucht. Um die Beteiligung nativer Rezeptorkomplexen zu untersuchen, wurden daher Mäuse trainiert und mit untrainierten Mäusen in MTM und BM verglichen. nach Ende des Trainings wurden die Mäuse euthanisiert, die Hippocampi entnommen, Proteine extrahiert und über native polyacrylamide Gels getrennt, gefolgt von Immunblotting mit spezifischen Antikörpern gegen murine Gehirnrezeptoren. Um die Gehirnrezeptoren, ihre post-translationale Modifikationen sowie ihre Zusammensetzung zu identifizieren, wurde eine Immunpräzipitation mit spezifischen Antikörpern gegen die Rezeptoren aus den Hippocampi sowie SDS-PAGEs durchgeführt. Die Bande wurden ausgestanzt, entfärbt und mit Trypsin und Chymotrypsin verdaut; die Peptide wurden mittels Nano-LC-ESI-MS/MS unter Verwendung einer Ionenfalle identifiziert. Wir fanden, dass sowohl die Rezeptorkomplexe, GluN1 und GluA1, welche in trainierten Maeusen erhoeht exprimiert sind, als auch GluA2, welcher in diesen Tieren reduziert scheint, mit Gedaechtnis assoziiert sind.außerdem, Die NMDA-Rezeptor- Untereinheiten und AMPA-Rezeptor-Untereinheiten, fünf neue Phosphorylierungsstellen auf NMDA (Serine S511 on GluN2A and S886, S917, S1303 und S1323 on GluN2B) und zwei Proteinkinasen, PKC gamma und Calcium / Calmodulin-abhängige Proteinkinase Typ-2-Untereinheit beta, die mit NMDA zugeordnet ist, wurden durch Massenspektrometrie identifiziert. Hiermit haben wir ein Verfahren zum Nachweis und zur Untersuchung von Rezeptorkomplexen aus dem Hippocampus bei Lernen und Gedächtnis geschaffen und den Wissensstand über Rezeptorkomplexe erweitert. Zusätzlich, neue Phosphorylierungsstellen am NMDA Rezeptor finden und diese Information ist wichtig für weitere Studien über PTM in bezug auf Lernen und Gedächtnis.

Zusammenfassung (Englisch)

Brain receptors are involved in synaptic changes underlying learning and memory in central nervous system. Although receptor subunits have been linked to memory formation, data on the involvement of the receptor complexes is limited. In addition, post-translation modifications account for a number of activities such as gene expression, activation /deactivation of enzymatic activity, protein stability or disruption, mediation of protein-protein interactions, and modulation of protein cellular function involved in signalling and regulatory mechanisms. Recent studies have addressed the involvement of post-translational modifications (PTMs) in cognitive processes. It is well documented that post-translation modifications such as phosphorylation of serine, threonine and tyrosine play a role in the synaptic plasticity of the brain, neurotransmitter release, and vesicle trafficking. The aim of our study was to investigate whether learning paradigms change the composition of NMDA- and AMPA- receptor complexes in mice. Subsequently, identification of receptor complexes, their post- translational modifications and their binding partners are proposed.

Therefore, in order to study the involvement of native receptor complexes, mice were trained and compared to untrained mice in MTM (Multiple T maze) and BM (Barnes maze). After the completion of training, mice were euthanized, hippocampal samples were taken, proteins were extracted and run on native polyacrylamide gels, followed by immunoblotting with specific antibodies against mouse brain receptors.

To identify the brain receptors, their post-translational modifications and their compositions, immunoprecipitation with specific antibodies against receptors from hippocampi was carried out and samples were run under denature condition. Spots were picked, destained, treated with trypsin and chymotrypsin, and peptides were identified by tandem mass spectrometry (Nano-LC-ESI-MS/MS). We found that the level GluN1- and GluA1-containing complexes increased in trained mice and GluA2-containing complexes decreased in trained mice. Furthermore, The NMDA receptor subunits (GluN1 and GluN2A-D), AMPA receptor subunits, five novel phosphorylation sites on NMDAR (Serine S511 on GluN2A and S886, S917, S1303 and S1323 on GluN2B), and two protein kinases (Protein kinase C gamma and Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 2 subunit beta), which are associated with NMDA receptor, were identified by mass spectrometry. Herein, we apply native polyacrylamide gels to determine and study hippocampal receptor complexes in learning and memory. The results extend our knowledge on NMDA- and AMPA- receptor complexes. In addition, five novel phosphorylation sites on NMDA receptor are detected. This new discovery is useful for further studies in terms of receptor's PTM quantification in learning / memory and disease.