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Title
Characterization of allergens involved in IgE-mediated wheat allergy / submitted by Sandra Pahr
AuthorPahr, Sandra
CensorValenta, Rudolf
Published2014
Description239 S. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2014
Annotation
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Triticum aestivum / Weizen / Allergie / Weizenallergie / Weizen-induzierte Krankheiten / Weizennahrungsmittelallergie / Bäckerasthma / rekombinante Weizenallergene / Diagnose von Weizenallergien
Keywords (EN)Triticum aestivum / wheat / allergy / wheat allergy / wheat-induced diseases / wheat food allergy / recombinant wheat allergens / diagnosis of wheat allergies
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-909 Persistent Identifier (URN)
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Characterization of allergens involved in IgE-mediated wheat allergy [8.32 mb]
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Abstract (German)

Ziel: Ziel meiner Dissertation war die Charakterisierung von IgE-reaktiven cDNA Klonen, welche von einer cDNA Bank aus Weizen isoliert wurden. Nachdem die Weizenallergene rekombinant hergestellt wurden war es unser Ziel, die Allergene sowohl biochemisch, biophysikalisch als auch immunologisch charakterisieren und für die Allergiediagnostik verwenden. Material und Methoden: Eine cDNA Bank aus Weizen (Triticum aestivum) wurde hergestellt und mit Serum IgE Antikörpern von Patienten mit Bäcker Asthma oder Weizen-abhängigen Nahrungsmittelallergie gescreent um neue Weizenallergene zu entdecken. Nachdem die Proteine in einem prokaryotischem (E.coli Bakterien) oder eukaryotischem (Bakulovirus-infizierte Insektenzellen) Expressionssystem rekombinant hergestellt wurden, wurden sie mittels Massenspektrometrie, Zirkulardichroismus, Größenausschluss-Chromatographie und chemischem Crosslinking biochemisch analysiert. RAST-basierende, nicht-denaturierende Dot-Blot Experimente wurden verwendet, um deren IgE-Reaktivität zu bestimmen und basophile Degranulierungsexperimente wurden durchgeführt um die allergene Wirkung der Proteine zu untersuchen. Zusätzlich wurden Allergen-spezifische Hasenantikörper verwendet um den Verlauf der Proteinexpression im Weizensamen, die Kreuzreaktivität, die Stabilität unter gastrischen oder duodenalen Bedingungen, als auch deren Hitzestabilität in verschiedenen Brotsorten nach dem Backen, zu untersuchen. Resultate: Im Zuge meiner Dissertation habe ich fünf verschiedene Bäcker Asthma- Allergene (Thioredoxin h, Glutathione transferase, 1-Cys-peroxiredoxin, Profilin und Dehydrin) charakterisiert, wobei 1-Cys-peroxiredoxin aufgrund der Prävalenz in der IgE Erkennung, den Ergebnissen der basophilen Degranulationstests und auch der immunologischen Kreuzreaktivität als das wichtigste Allergen unter ihnen beschrieben wurde. Des Weiteren haben wir ein neues Weizennahrungsmittelallergen, Alpha Purothionin (Tri a 37) identifiziert und charakterisiert. Dieses neue Allergen ist ein serologisches Markerallergen für die schwere Weizennahrungsmittelallergie. Fazit: Durch die Verwendung von rekombinanten Weizenallergenen in Microarray-basierenden Komponenten-auflösenden Diagnosverfahren kann eine detaillierte Diagnose und eine zusätzliche Unterscheidung der verschiedenen klinischen Manifestationen der Weizenallergien gemacht werden.

Abstract (English)

Objectives: Aim of my thesis was the characterization of IgE-reactive cDNA clones which were isolated from a wheat seed cDNA library. After recombinant production of wheat allergens, my aim was to characterize them regarding biochemical, biophysical and immunological properties and for the use in diagnosis of allergy. Material and Methods: A cDNA library (Triticum aestivum) from wheat seeds was constructed and screened with serum IgE antibodies from patients with baker's asthma or wheat-dependent food allergy to identify novel wheat allergens. After recombinant protein expression using a prokaryotic system (E.coli cells) or a eukaryotic system (baculovirus-infected insect cells), allergens were biochemically analyzed using mass spectrometry, circular dichroism spectroscopy, size exclusion chromatography and chemical crosslinking. RAST-based, non-denaturing dot blot experiments were used to determine their IgE-reactivity and basophil degranulation experiments were performed to investigate the allergenic activity. Additionally, allergen-specific rabbit antibodies were raised to study the course of protein expression during wheat seed maturation, cross-reactivity, their stability when subjected to gastric or duodenal digestion, as well as their heat stability in different bread sorts.

Results: In the context of my thesis, five baker's asthma allergens (thioredoxin h, glutathione transferase, 1-Cys-peroxiredoxin, profilin and dehydrin) were characterized. The cross-reactive allergen 1-Cys-peroxiredoxin was identified as the most relevant allergen according to prevalence of IgE-recognition and basophil degranulation assays. Additionally, we identified and characterized a new wheat food allergen alpha purothionin (Tri a 37) which was found to serve as a serologic marker for the diagnosis of severe wheat food allergy.

Conclusion: The use of recombinant wheat allergens in microarray-based component-resolved diagnostic tests allows a detailed diagnosis and may distinguish between various clinical manifestations of wheat allergies.