Titelaufnahme

Titel
Investigating the interaction of Hepatitis C virus non-structural protein NS5A with the methyltransferase SMYD3 / von Carol-Ann Eberle
Verfasser / VerfasserinEberle, Carol-Ann
Begutachter / BegutachterinSuperti-Furga, Giulio
Erschienen2015
UmfangVIII, 86 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Hepatitis C virus / Methyltransferase / SMYD3 / Nichtstrukturprotein / NS5A
Schlagwörter (EN)Hepatitis C virus / methyltransferase / SMYD3 / non-structural protein / NS5A
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-6851 Persistent Identifier (URN)
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Investigating the interaction of Hepatitis C virus non-structural protein NS5A with the methyltransferase SMYD3 [9.33 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das Hepatitis C Virus (HCV) gilt als eine der Hauptursachen für chronische Hepatitis und als häufigste Indikation für Lebertransplantationen. Mit 3% Infizierten in der Weltbevölkerung stellt HCV ein globales Gesundheitsproblem sowie ein wirtschaftliches Problem dar. Aktuelle Fortschritte in der Entwicklung von antiviralen Behandlungsmethoden haben die Zulassung einer Reihe von effizienten direkt-wirkenden antiviralen Substanzen ermöglicht. Gegeben in Kombination mit pegyliertem Interferon [alpha] (pegIFN [alpha]) und Ribavirin führen diese Medikamente bei HCV-Infektionen zu einer signifikant erhöhten Heilungsrate. Allerdings bleiben die hohen Kosten, schwere Nebenwirkungen und die Entwicklung resistenter Virenstämme weiterhin als ungelöste Probleme bestehen. Deshalb ist ein besseres Verständnis der noch immer weitgehend unerklärten Biologie des HCV Lebenszyklus wichtig für die Weiterentwicklung aktueller Behandlungsmethoden.

Das HCV nicht-strukturelle Protein NS5A ist ein multifunktionales Protein und essentiell zur Regulierung der viralen Replikation sowie des Viruspartikelaufbaus. Eine vorherige proteom-weite Studie zur Untersuchung der Virus-Wirt-Interaktion identifizierte die Lysin-Methyltransferase SMYD3 als ein neuartiges NS5A Bindungsprotein.

Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Interaktion nachgewiesen sowie aufgezeigt, dass SMYD3 sich an zwei hochkonservierte Proline (P417 and P418) in Domäne III des NS5A via seiner MYND Domäne bindet. Außerdem interagieren beide Proteine auch im Kontext einer viralen Infektion, wobei die Präferenz des SMYD3 in der hyperphosphorlierten Form des NS5A liegt. Funktionale Studien, welche das subgenome HCV Replikon- sowie das infektiöse Zelltkultursystem einsetzten, zeigten, dass SMYD3 die virale Partikelproduktion negativ reguliert, ohne jedoch Einfluss auf die virale RNA Replikation zu haben.

Im zweiten Teil der Arbeit wird untersucht, ob NS5A von posttranslationaler Methylierung reguliert wird. Eine wiederholte Analyse der verfügbaren NS5A Massenspektrometriedaten zeigte, dass Lysin K240 als mögliche Methylationsstelle denkbar ist. Mit wenigen Ausnahmen ist K240 über alle Genotypen hoch konserviert. Eine Westernblot-Analyse zeigte, dass die Einführung eines Alanin an dieser Stelle eine Verschiebung der Proteinbanden induzierte, welches der NS5A Hyperphosphorylierung gleicht. Zudem legte der Vergleich der Aktivität wildtypischer subgenomischer Replikone mit der Replikation verschiedener Mutanten nahe, dass das Residuum die Replikation in einer vom Genotyp abhängigen Manier beeinflusst. Insgesamt stellen die Ergebnisse heraus, wie die Veränderung desselben Residuums zu unterschiedlichen Genotyp-spezifischen Resultaten führen kann. Dies betont die Problematik während der Identifikation von pan-anti-HCV direkt-agierend antiviraler Medikamente. Gleichzeitig geht aus den gewonnenen Daten hervor, dass bei der Verwendung eines Massenspektrometers zur Identifikation posttranslationalen Methylationsstellen Vorsicht geboten ist

Zusammenfassung (Englisch)

Hepatitis C virus (HCV) is one of the major causes of chronic hepatitis and the most common indication for liver transplantation. With 3% of the world's population being infected, HCV constitutes a global health as well as economic burden. Recent progress in the development of antiviral treatment strategies has led to the approval of a set of very efficient direct-acting antivirals. Given in combination with pegylated interferon [alpha] (pegIFN [alpha]) and ribavirin, these drugs have significantly improved the cure rates of HCV. However, the high cost, severe side effects and the development of viral resistance remain a major challenge. Hence a better understanding of the yet enigmatic biology of the HCV life cycle is vital for improving current HCV treatment options. The HCV non-structural protein NS5A is a multifunctional protein and essential for regulating viral replication and particle assembly. A previous large-scale proteomic screen to map virus-host interactions identified the lysine methyltransferase SMYD3 as a novel NS5A binding protein. In the first part of this thesis I confirm the interaction and show that SMYD3 binds to two highly conserved prolines (P417 and P418) in domain III of NS5A via its MYND domain. Furthermore, both proteins also interact in the context of viral infection, with a preference of SMYD3 for the hyperphosphorylated form of NS5A. Functional studies using subgenomic HCV replicons as well as infectious cell-culture systems indicate that SMYD3 negatively regulates infectious virus particle production, while having no impact on viral RNA replication. In the second part I investigated the possibility of NS5A being regulated by post-translational methylation. Re-analysis of available NS5A mass-spectrometry data revealed lysine K240 as a potential methylation site. With few exceptions, K240 is highly conserved across all gentoypes. Introducing an alanine at this site induced a band shift observable by immunoblot resembling NS5A hyperphosphorylation. In addition, comparing wild type subgenomic replicon activity with replication of various point mutants suggested that this residue influences replication in a genotype-dependent manner. Overall, my results highlight how changing the same residue in distinct genotypes can have profoundly different outcomes, emphasizing the difficulties in identifying pan-anti-HCV direct-acting antivirals. At the same time, my data also highlight the need for caution when using mass-spectrometry for the identification of post-translational methylation sites.