Titelaufnahme

Titel
Antigen-specific and antigen-non-specific intervention strategies against allergy in mice
VerfasserAkgün, Johnnie
Begutachter / BegutachterinWiedermann-Schmidt, Ursula
Erschienen2015
Umfang131 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Allergene / Tiermodele / angeborene Immunität / alveolar epithelial Typ 2 Zellen / Antigenaufnahme
Schlagwörter (EN)Allergens / animal models / innate immunity / alveolar epithelial type II cells / antigen uptake
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-610 Persistent Identifier (URN)
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Antigen-specific and antigen-non-specific intervention strategies against allergy in mice [18.33 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Frühere Untersuchungen bezüglich intranasaler Toleranzinduktion zeigten die erfolgreiche Reduktion von allergischen Reaktionen mit Hilfe verschiedener Allergenkonstrukte (z.B. rekombinanten Allergenproteine, Polypeptide, Chimären und Peptiden). Es wurde jedoch nicht gezeigt wie Antigene mit verschiedenen Konformationen in den Schleimhäuten der Atemwege aufgenommen werden. In dieser Studie haben wir versucht, die Aufnahme in verschiedenen Zellpopulationen der Atemwege nach der intranasalen Verabreichung von drei strukturell unterschiedlichen Allergenen zu vergleichen. Hierzu wurden folgende drei Konstrukte verwendet: das Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1-Protein, ein lineares synthetisch hergestelltes Hybrid Polypeptid (Hybrid-Peptide) und das Bet v 1 Monopeptid (Bet v 1-Peptide). Das Markieren der drei verwendeten Konstrukte mittels 5,6-Carboxyfluorescein ermöglicht es deren Aufnahme in Zellen des nasal assoziierten lymphatischen Gewebes und in Lungenzellen von naiven konventionellen, Bet v 1 sensibilisierten oder naiven keimfreien BALB/c Mäusen zu untersuchen. Die phänotypische Zellcharakterisierung in Lungenzellen sowohl nach einer in vitro Inkubation als auch nach einer intranasalen in vivo Verabreichung der drei Antigene ergab für naiven konventionellen Mäuse, dass alveolar epitheliale Typ 2 Zellen (ATII), jedoch nicht professionelle Antigenpräsentierende Zellen (wie Dendritische Zellen, Makrophagen oder B Zellen) für die Antigenaufnahme in der Lunge verantwortlich sind.

Ähnliche Beobachtungen wurden in in vivo Studien an naiven keimfreien Mäusen gemacht. Im Falle von sensibilisierten Mäusen wurde festgestellt, dass Makrophagen hauptsächlich an der Antigenaufnahme in der Lunge verantwortlich sind. Um den Aufnahmemodus in die Zelle zu untersuchen, wurden rezeptorvermittelte Endozytose und Makropinozytose in der ATII-Zelllinie (A549) und aus Knochenmark generierten Dendritischen Zellen (BM-DCs) blockiert. Diese Inhibitionsversuche zeigen, dass sowohl in A549 Zellen als auch in BM-DCs rezeptorvermittelte Endozytose in der Aufnahme von Bet v 1-Protein und Hybrid-Peptide involviert ist. Die Blockade von Makropinozytose zeigt einen geringen Effekt in der Antigenaufnahme von Bet v 1-Protein und Hybrid-Peptide durch A549 Zellen, jedoch keinen Effekt in BM-DCs. Im Falle von Bet v 1-Peptide ist anzunehmen, dass diese durch direkte Zellpenetration in die Zelle aufgenommen wird. Desweiteren wurden ATII Zellen aus naiven konventionellen Mäusen nach der intranasalen Verabreichung von Bet v 1-Protein oder Bet v 1-Peptide, zur Untersuchung der mRNA isoliert.

Unsere Untersuchungen ergaben, dass Bet v 1-Protein einen Anstieg von TSLP mRNA verursacht, jedoch Bet v 1-Peptide die Transkription von IL-10 und MCP1 steigert. Zusätzlich wurden A549 Zellen zusammen (in direktem Kontakt oder durch eine Transmembran getrennt) mit einer Monozytenzelllinie in der Gegenwart von Bet v 1-Protein, Hybrid-Peptide oder Bet v 1-Peptide stimuliert. Im Anschluss wurden diverse Zytokine (IL-6, IL-8 und TGF[beta]) als auch die mRNA Transkription (IL-6, IL-8, IL-10, MCP1 und TSLP) gemessen. Die Stimulation von A549 Zellen welche in direktem Kontakt mit der Monozytenzellline standen führte zu einer vermehrten Ausschüttung von IL-6 und IL-8. Werden die Zellen durch eine Transmembran voneinander getrennt und zusammen mit Bet v 1-Peptide oder Hybrid-Peptide inkubiert, konnten eine erhöhte Transkription von IL-10 mRNA in A549 Zellen beobachtet werden. Im Falle von einer Inkubation mit Bet v 1-Protein wurde vermehrt TSLP mRNA in A549 Zellen transkripiert.

Diese Daten sind in Einklang mit unseren in vivo Beobachtungen. Unsere Daten zeigen, dass ATII Zellen nicht nur Zellen der Atemweg mit Barrierefunktion sind, sondern dass sie auch als wichtige Schlüsselfiguren in der Polarisation des Immunsystems fungieren können.

Diese Funktion scheint aber vorsätzlich von der Größe und der Konformation des aufgenommenen Allergens beeinflusst zu werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Our previous studies on intranasal tolerance induction demonstrated successfully the reduction of allergic responses with different allergen constructs (i.e. recombinant allergen proteins, polypeptides, chimers, and peptides). However, it has not been shown yet how these antigens with different conformations were taken up in the respiratory mucosa. In this study we therefore sought to compare the uptake of three structurally different allergens, i.e. the major birch pollen allergen Bet v 1-Protein, a linear synthetic hybrid poly-peptide and a Bet v 1 mono-peptide, by different cell populations of the respiratory tract following intranasal application. The three-dimensional recombinant Bet v 1-Protein, the poly-peptide (Hybrid-Peptide) and the mono-peptide of Bet v 1 (Bet v 1-Peptide) were labelled with 5,6-Carboxyfluorescein and their uptake was investigated in cells of the nasal associated lymphoid tissue (NALT) and lung cells from conventional naive and Bet v 1-sensitised or naive germ-free BALB/c mice. Phenotypic cell-characterisation of lung cells after antigen incubation in vitro, and after intranasal application in vivo was performed by flow cytometry. In vivo and in vitro studies in naive conventional mice indicated that alveolar epithelia type 2 (ATII) cells, but not the professional antigen presenting cells - dendritic cells, macrophages or B cells - were the major cell population in lungs taking up all three investigated antigens. Similar observations were made in in vivo studies with naive germ-free mice, whereas macrophages represent the dominant antigen-internalising cell population in sensitised mice. In order to investigate the pathway of antigen uptake within the cell, receptor mediated endocytosis or macropinocytosis were blocked in cells of an ATII cell line (A549) and bone marrow-derived dendritic cells (BM-DCs). From these blocking experiments it is possible to suggest that receptor mediated endocytosis is partly involved in the internalisation of Bet v 1-Protein and Hybrid-Peptide in A549 cells and BM-DCs. On the other hand, blockade of macropinocytosis had only a minor effect on the antigen uptake of Bet v 1-Protein and Hybrid-Peptide in A549 cells but not in BM-DCs. In contrast, the used blocking strategies had no effect on the internalisation of Bet v 1-Peptide in A549 cells or in BM-DCs, suggesting that Bet v 1-Peptide is internalised via direct cell penetration. Furthermore, ATII cells were isolated from lungs of naive conventional mice after intranasal application of Bet v 1-Protein or Bet v 1-Peptide in order to investigate the mRNA profile in vivo. Our analyses show an increase of TSLP mRNA levels after Bet v 1-Protein application, whereas Bet v 1-Peptide induced transcription of IL-10 and MCP1 in ATII cells. Additionally, A549 cells were co-cultured (directly or in transwells) with monocytes in the presence of Bet v 1-Protein, Hybrid-Peptide and Bet v 1-Peptide, followed by investigations on cytokine release (IL-6, IL-8 and TGF[beta]) and mRNA transcription (IL-6, IL-8, IL-10, MCP1, and TSLP). Stimulation of direct co-culture with Bet v 1-Peptide and Bet v 1-Protein resulted in enhanced secretion of IL-6 and IL-8, whereas incubation with Hybrid-Peptide induced only IL-6 release. Stimulation with Bet v 1-Peptide and Hybrid-Peptide gave rise to enhanced levels of IL-10 mRNA, while stimulation with Bet v 1-Protein led to increased transcription of TSLP mRNA in A549 cells of transwell co-cultures. While freshly isolated ATII cells are described to transdifferentiate towards an ATI phenotype in vitro, our data generated in A549 cells are in line with our in vivo findings, demonstrating that A549 cells can be used for further investigations, Our data indicate that ATII cells are not only respiratory cells with barrier functions but may also function as important key players in polarisation of the immune system in dependence of the size of the internalised allergen under steady state conditions.