Titelaufnahme

Titel
Developing a bacterial artificial chromosome-based expression system for recombinant protein production in mammalian cells
VerfasserZboray, Katalin
Betreuer / BetreuerinCasanova, Emilio
Erschienen2016
Umfang84 Blatt
HochschulschriftWien, Univ., Diss., 2016
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeDezember 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Rekombinante Proteinproduktion / CHO Zellen / Expressionsvektoren basierend auf Artifiziellen Bakteriellen Chromosomen / HIV Oberflächenprotein und neutralisierende Anti- HIV-1 Antikörper
Schlagwörter (EN)recombinant protein production / CHO cells / Bacterial Artificial Chromosome based vectors / HIV antigens and broadly neutralizing HIV specific antibodies
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Zusammenfassung (Deutsch)

Rekombinante Protein-Therapeutika werden ausschließlich von tierischen Zelllinien produziert, die die kodierende Region des Proteins stabil in ihr Genom eingebaut haben. Konventionell wird die kodierende Sequenz des Proteins mit einem DNS Vektor in die Zelle eingebracht und integriert danach zufällig in das Genom der Host-Zelle. Aufgrund der Genorganisation der Host-Zelle, hat die Stelle der Integration einen großen Einfluss auf die Proteinproduktion. Es gibt mehrere Möglichkeiten, diese sogenannten Chromatin Positionseffekte zu umgehen, um die Protein Expression weniger abhängig von der Intergrationsstelle am Genom zu machen. Anstatt spezifischer regulativer Elemente auf dem DNS Vektor, verwendeten wir offene Chromatin Regionen um ein günstiges Gen-Umfeld zu schaffen. Dafür generierten wir ein Set von Expressionsvektoren basierend auf Artifiziellen Bakteriellen Chromosomen (BACs) und untersuchten den Einfluss unterschiedlicher Promotoren und zusätzlicher regulativer Elemente, in Kombination mit dem günstigen Gen-Umfeld, auf die Auswirkung der rekombinanten Proteinproduktion. In unseren Experimenten verwendeten wir Chinesische Hamster Ovarienzellen (CHO), da diese, die am häufigsten verwendeten tierischen Zellen zur rekombinanten Proteinproduktion im industriellen Maßstab sind. Wir identifizierten ein BAC, welches das murine Rosa26 Gen trägt, als bestgeeigneten Vektor für die Produktion eines, von einem Antikörper abgeleiteten, IgG-Fc Modellproteins. Die Verwendung dieses Rosa 26 BAC DNS-Rückgrats in Kombination mit dem Caggs Promotor verbesserte die Protein Expression in stabilen Zellpools und in einzelnen Klonen um das 9-fache im Vergleich zu herkömmlichen Vektoren. Darüber hinaus war, im Gegensatz zur herkömmlichen Plasmid Kontrolle, die Protein Expression proportional zur Anzahl der Transgen-Kopien und stabil über einen Zeitraum von 10 Wochen ohne der Verwendung eines Selektionsdruckes. Abschließend konnten wir die Zweckmäßigkeit des BAC Vektors mit der Produktion von zwei weiteren Proteinen zeigen. Sowohl das stark glykosylierte HIV Oberflächenprotein gp140 (CN54) als auch der neutralisierende Anti- HIV-1 Antikörper PG9 konnten erfolgreich produziert werden. Für beide Produkte konnte ein Ertrag von 1 g/L in Schüttelkolben und Labor-Bioreaktoren erzielt werden. Zusammenfassend konnte der Machbarkeitsnachweis, dass BAC basierende Vektoren die rekombinante Proteinproduktion, auch in industriellen Anwendungen verbessern können, erbracht werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Mammalian cell derived recombinant therapeutic proteins are solely produced by cell lines harboring the coding region of the protein of interest stably integrated in their genome. Conventionally, the coding sequence of the heterologous protein is introduced to the cells on a vector DNA which integrates in a random manner into the host cells genome. The place of genomic integration has a major impact on protein expression levels due to the effects of the surrounding gene environment: these effects are collectively called “chromatin positional effects”. There are several strategies aiming to overcome these chromatin positional effects, such as the use of small genetic elements. A number of these cis-regulatory genetic elements were shown to make protein expression less dependent on chromatin positional effects. As an alternative to these cis-elements, we have explored high cloning capacity vectors harboring large open chromatin genomic regions as a supportive genetic environment to overcome chromatin positional effects. We created a set of Bacterial Artificial Chromosome (BAC) based expression vectors and tested the impact of different promoters and gene regulatory elements in combination with the active genetic environment on recombinant protein production. We used Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in our experiments as these are the most widely used cell lines for industrial applications. We identified the BAC containing the murine Rosa26 genomic region as the most effective vector backbone for the expression of our antibody derived model protein, IgG-Fc. The use of the Rosa26 BAC backbone in combination with the Caggs promoter improved the production of stable transfected cell pools and single cell clones nine-fold compared to a conventional plasmid based control. Moreover, unlike in plasmid derived stable cells, protein production in BAC derived single cell clones was proportional to integrated vector copy numbers and was stable during a ten-week culturing period without selection pressure. Finally, we could show the usefulness of BAC-vectors in the production of two other proteins. The heavily glycosylated HIV envelop protein trimer CN54gp140 as well as the broadly neutralizing HIV-1 antibody PG9 were produced successfully with BAC-based vectors. Both proteins reached a 1 g/l production yield in shake flasks and benchtop bioreactors showing a proof of principle that BAC-based vectors can provide improved protein production not only in lab scale but also in industrial applications.