Titelaufnahme

Titel
Do the binding sites of substrates and tricyclic antidepressants overlap on the human serotonin transporter? / submitted by Subhodeep Sarker
Verfasser / VerfasserinSarker, Subhodeep
Begutachter / BegutachterinFreissmuth, Michael
Erschienen2010
Umfang74 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Serotonin-Transporter / trizyklische Antidepressiva / kompetitive Hemmung / Leucin-Transporter / Ibogain
Schlagwörter (EN)serotonin transporter / tricyclic antidepressants / competitive inhibition / leucine transporter / ibogaine
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8269 Persistent Identifier (URN)
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Do the binding sites of substrates and tricyclic antidepressants overlap on the human serotonin transporter? [0.8 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Nach neuronaler Stimulation werden Neurotransmitter in den synaptischen Spalt freigesetzt. Dort aktivieren sie prä- und postsynaptische Rezeptoren, um das elektrische Signal weiterzuleiten und über Rückkopplung ihre eigen Freisetzung zu steuern. Die synatische Neurotransmission unterliegt einer strengen räumlichen und zeitlichen Regulation durch membranstänfige Transporter aus der NSS/SLC6Familie ( "neurotransmitter:sodium symporters" =solute carier 6). Diese Tranporter sind an der präsynaptischen Nervendigung exprimiert und vermitteln die rasche Rückaufnahme des freigestezten Neurotransmitters aus dem synaptischen Spalt. Erste Einblicke in ihre drei-dimensionale Struktur wurden durch die Kristallisation eines bakteriellen Orthologen gewonnen, nämlich LeuTAa ein Leucintransporter des thermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus. Die erste Kristallstruktur zeigt eine Konformation, die amehseten dem Übergangszustand ("occluded state")zwischen der auswärts und der einwärts gerichteten Konformation von LeuTAa entspricht. Von großem Interesse waren die in der Folge gelösten Strukuren, die LeuTAa in einem Komplex mit den trizyclischen Antidepressiva (TCA's) Clomipramin, Desipramin, Imipramin und Amitriptylin zeigten. Diese ermöglichten es, Modellvorstellungen zu entwickeln, wie die menschlichen NSS-Vertreter, inbesondere der Serotonintransporter (SERT), durch Inhibitoren gehemmt werden. Allerdings ist die Hemmung von LeuTAa durch TCA's nicht-kompetitiv, während TCA's den Serotonintransporters (SERT) kompetitiv hemmen. Dieser Widerspruch stellt die Gültigket von LeutAa als Modell für SERT in Frage. Die vorliegenden Experimente gehen von der Arbeitshypothese aus, dass diese Diskrepanz unter der Annahme erklärt werden kann, dass TCA's im äußeren Vestibül binden und dass ihre Seitenkette in die Substratbindungsstelle reicht. Weil Serotonin gößer als Leucin ist, verhindert dies die gleichzeitige Bindung von Serotonin und TCA's. Diese Hypothese wurde durch zwei Ansätze geprüft: (i) Verdränungsexperimente mit Carbamazepin (einem Analogon vn Imipramin, das nur eine kurze aliphatische Seitenkette hat und das die Bindung von [3H]Imipramin an SERT kompetitiv hemmt), (ii) gerichteter Mutagenese, mit der ich eine diagnostische SERTY95F Mutation erzeugte. Die Entfernung der Hydroxylgruppe setzte erwartungsgemäß die Affinität von [3H]Imipramin herab, hatte aber keinen Einfluss auf Substratbindung und Translokation. Mit Dixon Plots ließ sich nachweisen,dass Carbamazepin gleichzeitig mit Serotonin, Paroxetine oder Ibogain an den Transporter gebunden sein konnten. Hingegen war die gelichzeitige Bindung von Amphetaminen, nämlich para-Chloroamphetamin (PCA) oder Methylen-Dioxi-Methamphetamine (MDMA = 'ecstasy'), und von Carbamazepine nicht möglich. Diese Beobachtungen sind daher mit dem folgendeb Modell vereinbar: (i) Der trizyclische Ring von TCA's liebt im äußeren Verstbül von SERT und die Dimethylaminopropyl-Seitenkette bestezt die Substratbindungsstelle. (ii) Die Bindung von Amphetaminen führt zu einer Konformationsänderung im inneren und äußeren Vestibül, die ihre gleichzeitige Besetzung durch den trizyclischen Ring verhindert. (iii) Die simultane Bindung von Ibogain (das an die einwärts-gerichtete Konformation bindet) und von Carbamazepin an SERT ist mit einer zweiten niederaffinen Bindungsstelle im inneren Vestibül vereinbar. Dies stimmt mit der Pseudosymmetrie von NSS Proteinen und mit Hinweisen für eine zweite niederaffine Bindungsstelle von Imipramin.

Zusammenfassung (Englisch)

Upon neuronal stimulation, neurotransmitters are released into the synaptic cleft where they activate both pre- and post-synaptic receptors for propagation of the electrical nerve impulse.

Neurotransmission across a synapse is under tight spatio-temporal regulation by high-affinity membrane transport proteins of the neurotransmitter:sodium symporter (NSS)-family. NSS proteins are localized on the pre-synaptic nerve terminals. They mediate rapid retrieval of the released neurotransmitters from the synaptic cleft. The first insight into the three-dimensional structure of this class of proteins was obtained by crystallization of the prokaryotic NSS member, LeuTAa, isolated from the thermophilic bacterium, Aquifex aeolicus. The first structure revealed a conformation likely representing an intermediate (i.e., the occluded state) between the 'outward-' and 'inward-' facing conformations of LeuTAa. Subsequent crystal structures of LeuTAa bound to tricyclic antidepressants (TCAs) viz., clomipramine, desipramine, imipramine and amitriptyline afforded mehanistic insights into the inhibition of NSS proteins. A major limitaion was noted: the inhibition of LeuTAa by TCAs is non-competitive, but TCAs are competitive inhibitors of the human serotonin transporter (SERT). Hence there is an obvious discrepancy, which questions the validity of the LeuTAa-based model. My thesis is based on the working hypothesis that the discrepancy can be resolved by assuming that TCA's bind in the outer vestibule and that their side chain reaches into the substrate binding site. Because serotonin is larger, this precludes simultaneous binding of serotonin and TCA's. I adressed this discrepancy via two approaches:

(i) competition binding experiments with carbamazepine (i.e., an imipramine analog with a short aliphatic side chain, which was verifed to compete with [3H]imipramine binding to SERT), (ii) site-directed mutagenesis where I generated a diagnostic SERTY95F mutation which greatly reduced the affinity for [3H]imipramine but did not affect substrate binding. Dixon plots revealed that carbamazepine bound simultaneously to SERT in the presence of serotonin, paroxetine or ibogaine. In contrast, the binding of amphetamines, viz.

para-chloroamphetamine (PCA) or methylene-dioxy-methamphetamine (MDMA or, 'ecstasy') and of carbamazepine was mutually exclusive. My observations are consistent with the following model: (i) the tricyclic ring of TCAs resides in the outer vestibule of SERT and the dimethyl-aminopropyl side chain occupies the substrate binding pocket; (ii) binding of amphetamines to SERT creates a structural change in the inner and outer vestibules which precludes simultaneous occupancy of the tricyclic ring in the vestibules, (iii) simultaneous binding of ibogaine (which binds to the 'inward-facing' conformation) and of carbamazepine to SERT is indicative of a second low-affinity binding site in the inner vestibule, consistent with the pseudo-symmetric fold of NSS proteins.