Titelaufnahme

Titel
Binding of SAP102 and USP4 to the A2A adenosine receptor carboxyterminus / eingereicht von Ivana Ostrouska
Verfasser / VerfasserinOstrouska, Ivana
Begutachter / BegutachterinNanoff, Christian
Erschienen2009
Umfang61 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Dipl.-Arb., 2009
Anmerkung
Zusammenfassung in engl. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)A2A Adenosine Rezeptor / SAP102 / USP4
Schlagwörter (EN)A2A adenosine receptor / SAP102 / USP4
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8209 Persistent Identifier (URN)
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Binding of SAP102 and USP4 to the A2A adenosine receptor carboxyterminus [4.66 mb]
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Zusammenfassung (Englisch)

The A2A adenosine receptor has an extended cytoplasmic carboxyl terminal tail (c-tail) that contains putative docking sites for accessory cellular proteins. The binding of two candidate interaction partners to the receptor c-tail, these are (i) the MAGUK (membrane-associated guanylate kinase-like domain) protein SAP102 (synapse associated protein of 102 kDa) and (ii) the ubiquitin-specific protease USP4 was evaluated. The yeast-two-hybrid test was employed to assess interaction with the receptor c-tail at its original length and with several variants that had been truncated from the distal end.

Various subdomains (PDZ, SH and GUK) were isolated from the multi-domain protein SAP102 and tested separately; the substrate recognition domain (DUSP) was used in case of USP4. For SAP102 a series of interaction tests indicated that the receptor c-tail binds - by virtue of a five-residue motif located at position 382-386 (that is 22 amino acids removed from the c-terminal end) - to the GUK domain. Signal transduction was examined by a receptor mutant where the original five-residue motif (DVELL) had been supplanted by an alternative sequence (RVRAA) such that the receptor could not bind to SAP102. In HEK293 cells neither expression of the receptor nor receptor-dependent formation of cAMP or activation of the MAP-kinase ERK1/2 differed between mutant and wild-type receptor. In contrast to SAP102, the binding site of the USP4-DUSP domain could not be unambiguously mapped on the receptor c-tail. Progressive truncation of the human c-tail identified a candidate interaction site that however was not detected in the highly homologous sequence of the mouse species orthologue. Thus, the conclusion is that (i) the yeast-two-hybrid interaction test may have limitations requiring the results to be re-evaluated by an independent experimental approach and that (ii) the consequence of mutating the SAP102 interaction site in the receptor should be revealed when the mutant receptor is expressed in a neuronal cell.

Zusammenfassung (Deutsch)

Der A2A Rezeptor hat einen abstehenden cytoplasmatischen carboxyl-terminalen Schwanz (c-tail). Dieser beinhaltet potentielle Andockstellen für bestimmte zelluläre Proteine. Die Bindung von zwei Interaktionspartnern an diesen c-tail wurde untersucht. Zu diesen zählen (i) das MAGUK (Membran Assoziierte Guanylase Kinase-ähnliche Domain) SAP102 (Synapse Assoziiertes Protein von 102kDa) und (ii) die Ubiquitin-spezifische Protease USP4. Mittels Yeast-two-Hybrid Test wurde die Interaktion zwischen diesen zwei Proteinen und verschiedenen Varianten des c-tail, mit originaler Länge und vom distalen Ende an trunkierte Varianten, untersucht. Vom Multidomain Protein SAP102 wurden zusätzlich die verschiedenen Subdomains (PDZ, SH und GUK) isoliert und getrennt getestet, sowie von USP4 die Substraterkennungsdomain (DUSP).

Im Falle von SAP102 konnte in mehreren Interaktionstests gezeigt werden, dass der c-tail des A2A Rezeptors mittels 5 Aminosäuren zwischen Position 382-386 an die GUK Domain bindet. Die Signaltransduktion wurde auch in einer bindungs-unfähigen Mutante, in welcher anstatt der originalen Sequenz (DVELL) eine alternative Sequenz (RVRAA) verwendet wurde, untersucht. In HEK293 Zellen führte weder die Expression des Rezeptors, noch die rezeptor-abhängige cAMP-Produktion oder die Aktivierung der MAP-Kinase ERK1/2 zu unterschiedlichen Ergebnissen im Vergleich zwischen mutierten und Wildtyp Rezeptor.

Im Unterschied zu SAP102, konnte für USP4 keine eindeutige Bindungsstelle am c-tail des A2A Rezeptors entdeckt werden. Durch progressive Trunkierung des c-tails konnte eine potentielle Interaktions-Sequenz ermittelt werden. Diese konnte jedoch in analogen Experimenten mit den homologen A2A Rezeptor c-tail der Maus nicht bestätigt werden. Aus diesen Ergebnissen kann daher geschlossen werden, dass (i) der Yeast-two-Hybrid Methode in diesem Fall an bestimmte Grenzen stößt, und diese Ergebnisse durch andere unabhängige Methoden reevaluiert werden sollten, und dass (ii) die SAP102-Interaktionsstelle im A2A Rezeptor, sowohl als Wildtyp als auch als Mutante, nachfolgend in Nervenzellen untersucht werden sollte.