Titelaufnahme

Titel
Interaction of receptors and ion channels in neuronal cells / by Klaus Schicker
VerfasserSchicker, Klaus
Begutachter / BegutachterinBöhm, Stefan
Erschienen2010
Umfang101 S. : graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Rezeptor / Ionenkanal / GPCR / Neuron
Schlagwörter (EN)Receptor / ion channel / GPCR / neuron
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8399 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Interaction of receptors and ion channels in neuronal cells [1.57 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit er Interaktion von Ionenkanälen und Rezeptoren in neuronalen Zellen. Dabei wurden zwei spezielle Beispiele im Detail untersucht. Als erstes dieser beiden Beispiele diente die negative Interaktion zwischen ligandengesteuerten Ionenkanälen. In der Literatur finden sich einige Berichte über eine solche wechselseitige Beeinflussung, wobei der Grossteil dieser Studien in heterologen Expressionssystemen durchgefürht wurde. Allerdings liegen auch Berichte von neuronalen Zellkulturen vor. Der Effekt einer solchen negativen Interaktion kann mit Hilfe elektrophysiologische Methoden gemessen werden. Dabei wird die Differenz von tatsächlich gemessenem Strom bei gleichzeitiger Applikation von zwei Agonisten für zwei unterschiedliche ligandengesteurte Io- nenkanäle und der linearen Summe der beiden Ströme die durch einzelne Applikation der jeweiligen Agonisten ausgelöst wurden verglichen. Auf diese Art wurde zwar bereits eine Reihe unterschiedlicher Interaktionen beschrieben, der dahinterstehende Mechanismus blieb bisher allerdings unklar.

Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir einen Grossteil der publizierten Interaktionen in symphatischen Neuronen der Ratte reproduzieren und zusätzlich eine weitere, bisher nicht beschriebene, Wechselwirkung, zwischen nikotinischen Acetylcholin Rezeptoren und [gamma]-amino Buttersäure Rezeptoren, feststellen. Dabei zeigte sich, dass der Effekt unabhängig von G-protein Aktivierung ist, das Ausmass der Interaktion von der Menge an aktivierten Rezeptoren abhängt, dabei allerdings nicht vom Ionenfluss durch diese bee- influsst wird. Des Weiteren wurde ein Abhängigkeit von der Membranspannung festgestellt, wobei die Interaktion bei hyperpolarisierten Potentialen am stärksten war und bei zunehmender Depolarisation abnahm.

Die genaue Wirkungsweise konnte nicht festgestellt werden. Allerdings wurde, durch genaue Analyse der elektronischen Ersatzschaltbilder festgestellt, dass eine technische Unzulänglichkeit der Messmethode mit grosser Wahrscheinlichkeit zu den beschriebenen Effekten führt. Das zweite Beispiel beschreibt eine funktionellen Verbindung zwischen P2Y1 Rezeptoraktivierung und der Aktivitiät von Ca2+ aktivierten K+ Kanälen.

Dies soll als Beispiel einer "second messenger" vermit- telten Interaktion dienen. Hierbei wurde festgestellt, dass in PC12 Zellen die stabil P2Y1 Rezeptoren exprimierten und in einen neuronenartigen Phänotyp differenziert worden waren, eine Applikation von Adenosin diphosphat zur Generierung von transienten Auswärtsströmen führt. Wie wir zeigen konnten handelt es sich hierbei um einen K+ getragenen Strom, dessen Induzierung durch spezifische P2Y1 An- tagonisten aufzuheben war.

Des Weiteren konnten wir demonstrieren, dass das Enzym Phospholipase C eine wichtige Rolle in der Signalkaskade spielt, da nach der Inhibition des Proteins keinerlei Ströme mehr gemessen werden konnten. Als nächster Schritt im Signalweg konnte mit Hilfe von Fura2 Ca2+ Imaging eine Freisetzung von Ca2+ aus dem endoplasmatischen Retikulum identifiziert werden, welche nur in Zellen zu beobachten war die P2Y1 Rezeptoren exprimierten, nicht aber in Wildtyp Zellen. Ein weit- erer Hinweis für die Bedeutung dieses Schrittes war, dass die Ströme nach Behandlung mit Thapsigarin, einer Substanz die zur Entleerung der intrazellulären Ca2+ Speicher führt, Adenosin Diphosphat keine Wirkung mehr zeigte. Als finaler Effektor wurden mit Hilfe von spezifischen Blockern Ca2+ aktivierte K+ Kanäle der KCa2 Familie identifiziert.

Um die Relevanz des Effektes auch in neuronalen Zellen zu zeigen, wurden ähnliche Experimente auch in hippocampalen Neuronen durchgeführt. Auch in diesen rief Adenosin Diphosphat einen Auswärtsstrom hervor, welcher wie in PC12 Zellen durch P2Y1 selektive Antagonisten, Thapsigargin Behandlung sowie KCa2 Blocker unterdrückt werden konnte. Diese Daten zeigen, dass der in PC12 Zellen gefundene Effekt auch in neuronalen Zellen eine Rolle spielt.

Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Aktivierung von P2Y1 Rezeptoren zu einer Aktivierung von Phospholipase C führt, was wiederum zu einer Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern fürht. Dies verursacht zu guter letzt eine Aktivierung von Ca2+ aktivierten K+ Kanälen.

Zusammenfassung (Englisch)

This work focuses on the interaction of ion channels and receptors in neuronal cells, studying two different kinds of these interactions in detail. The first of these both examples is the direct interaction of ligand gated ion channels in rat sympathetic neurons.

There is a large body of evidence, mainly from heterologous expression studies, but also from primary neurons, showing that ligand gated ion channels may interact with each other. The effect of such an interaction can be measured using electrophysiological measurement techniques. In these experiments the effect is shown as the difference of the actually measured current upon simultaneous activation of two different ligand gated ion channels and the linear sum of the individual currents. Even though several interacting channels have been found, so far the mechanism of interaction remains elusive. In rat sym- pathetic neurons we were able to recapitulate earlier findings and describe an previously not described interaction between nicotinic acetylcholine receptors and [gamma]-aminobuturic acid receptors. We could show, that this interaction is independent of G-protein activation, clearly dependent on the amount of receptors activated but independent of the ion flux through the channels. Furthermore the amount of negative in- teraction depends on the membrane voltage, being strongest at hyperpolarized potentials and gradually declining the more the membrane gets depolarized.

The mechanistic basis of the effect still remains unclear. However, as we could demonstrate by carefully analyzing the electronic equivalent circuits of the patch clamp system, the most plausible mechanism behind the negative interaction of two ligand gated ion channels is a measurement artifact caused by the inherent limitations of voltage clamp circuitry.

The second example describes a functional link between P2Y1 receptors and Ca2+ activated K+ channels, representing a second messenger mediated effect. PC12 cells that were stably expressing P2Y1 receptors, were differentiated into a neuron like phenotype. Treatment of these cells with adenosine diphosphate led to the induction of a transient outward current. As we could show this current is carried by K+ and can be suppressed by specific P2Y1 receptor inhibitors. Phospholipase C activation is crucial since inhibition of the enzyme also completely blocks the induction of the current. Using Fura2 Ca2+ imaging we could demonstrate, that adenosine diphosphate treatment leads to a increase in the level of intracellular Ca2+ in PC12 cells that were expressing P2Y1 receptors, but not in wildtype cells. Finally we could show, that the currents are caused by KCa2 channel activation via the release of Ca2+ from intracellular stores, since KCa2 specific blockers significantly suppressed the currents and when the stores were emptied via thapsigargin pretreatment adenosine diphosphate was ineffective in triggering an outward current.

To demonstrate the importance of the effect in primary neurons, similar experiments were conducted in rat hippocampal neurons. Similar to PC12 cells, also in these cells adenosine diphosphate triggered an outward current that was sensitive to blockers of KCa2 channels, P2Y1 receptor antagonists and thapsigarin pretreatment, demonstrating that the mechanism found in PC12 cells is also present in rat hippocampal neurons.

These data demonstrates that P2Y1 receptor activation leads to phospholipase C activation and subse- quent Ca2+ release from intracellular stores, which in turn activates Ca2+ activated K+ channels.