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Title
Mutations in the carboxyl terminal sec24 binding motif of the serotonin transporter impair folding of the transporter / submitted by Ali El-Kasaby
AuthorEl-kasaby, Ali
CensorFreissmuth, Michael
Published2010
DescriptionVI, 76 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss.
Annotation
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Endoplasmatisches Retikulum (ER), intrazellulären Transport, Membranproteine, Neurotransmitter Transport, Neurotransmitter, Pharmacochaperone, Serotonin und Serotonin-Transporter
Keywords (EN)Endoplasmic reticulum(ER), Intracellular trafficking, Membrane proteins, Neurotransmitter transport, Neurotransmitters, Pharmacochaperone, Serotonin and Serotonin transporter
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8436 Persistent Identifier (URN)
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Mutations in the carboxyl terminal sec24 binding motif of the serotonin transporter impair folding of the transporter [1.54 mb]
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Abstract (German)

Der Serotonin-Transporter (SERT) ist ein Mitglied der Familie der solute SLC6 Transporter. Dei Dauer der synaptischen Neurotransmission wird auch durch SERT bestimmt, weil der Transporter freigesetztes Serotonin in das präsynaptische Terminal aufnimmt. Um diese Funktion wahrzunehmen, muss SERT aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER, dem Ort seiner Synthese) an die präsynaptische Membran gelangen und dabei durch verschiedene Kompartimente gelangen. Beim Verlassen des ER der intrazellulär gelegene Carboxy-Terminus von SERT eine wichtige Rolle. Hier untersuchte ich die Bedeutung des C-Terminus von SERT für seine Faltung. Serielle Verkürzungen des C-Terminus und gerichtete Mutagenese identifizierten Sequenzspots (PG601, 602, RII607-609) innerhalb der C-Terminus, die für Faltung und/oder Export von SERT aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) entscheidend sind.

RI607, 608 ist homolog zu der RL-Motiv, das in anderen Familienmitgliedern SLC6 als Andockstelle für die COPII Komponente Sec24D dient. Die an den Positionen PG601, 602 und RI607, 608 mutierten Transporter konnten den Inhibitor [3H]Imipramin nicht binden; im Gegensatz dazu bindet der Wildtyp-Transporter, der im ER (z. B. durch dominant negatives SAR1a) retiniert wird, [3H]Imipramin mit einer Affinität, die derjenigen an der Zelloberfäche residierenden Transporter vergleichbar ist. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass der primäre Defekt eine Beeinträchtigung der Faltung der mutierten Transporter ist.

Die Expression von funktionell aktivem SERT-RI607,608AA und SERT-RII607-609AAA wurde teilweise durch Behandlung der Zellen mit dem unspezifischen chemischen Chaperon DMSO (Dimethylsulfoxid) oder durch Ibogain - aber nicht von anderen Klassen von Liganden (Inhibitoren, Substrate, Amphetamine) - wieder hergestellt. Ibogain bindet an die einwärts gerichtete Konformation des SERT. Diese Beobachtungen (i) zeigen eine bisher nicht bekannte Rolle des C-Terminus in der Faltung von SERT, (ii) weisen darauf hin, dass die Faltung von SERT über die nach innen weisende Konformation und (iii) sind mit einem Modell kompatibel, wo die RI-Motiv spielt eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung vorzeitiger Sec24-Einstellungs-und Ausfuhr von falsch gefaltete Transporter.

Abstract (English)

The serotonin transporter (SERT) is a member of the SLC6 family of solute carriers. SERT plays a crucial role in synaptic neurotransmission by retrieving released serotonin. The intracellular carboxyl terminus of various neurotransmitter transporters has been shown to be important for the correct delivery of SLC6 family members to the cell surface. Here we studied the importance of the C-terminus in trafficking and folding of human SERT. Serial truncations followed by mutagenesis identified sequence spots (PG601,602, RII 607-609) within the C-terminus relevant for export of SERT from the endoplasmic reticulum (ER). RI607, 608 is homologous to the RL-motif that in other SLC6 family members provides a docking site for the COPII component Sec24D. The primary defect resulting from mutation at PG601, 602 and RI607, 608 was impaired folding, because mutated transporters failed to bind the inhibitor [3H]imipramine. In contrast, when retained in the ER (e.g., by dominant negative Sar1) the wild type transporter bound [3H]imipramine with an affinity comparable to that of the surface expressed transporter. SERT-RI607, 608AA and SERT-RII607-609AAA were partially rescued by treatment of cells with the nonspecific chemical chaperone DMSO or the specific pharmacochaperone ibogaine (which binds to the inward facing conformation of SERT) but not by other classes of ligands (inhibitors, substrates, amphetamines). These observations (i) demonstrate a hitherto unappreciated role of the C-terminus in the folding of SERT, (ii) indicates that the folding trajectory proceeds via an inward facing intermediate and (iii) suggest a model where the RI-motif plays a crucial role in preventing premature Sec24-recruitment and export of incorrectly folded transporters.